微量化學實驗:誰是口水王 —酸鹼性和溫度對澱粉酶催化效率之影響 / 張馨云、佘瑞琳

星期二 , 12, 七月 2016 Leave a comment

微量化學實驗:誰是口水王
酸鹼性和溫度對澱粉酶催化效率之影響

張馨云、佘瑞琳*

國立臺灣大學化學系
*shirlin@ntu.edu.tw

n  前言

相信大家都有「望梅止渴」,或是看牙醫時,由於口不能閉,而口水一直分泌的經驗。的確,一個人在一天中會因狀況不同而有不同程度的口水分泌,大約每天分泌11.5公升至口腔中。唾液腺分泌出來的口水經由管道送到口腔中,它可使我們的口腔保持濕潤、幫忙清潔口腔、潤滑食物使易於吞嚥,同時還具有幫助消化的作用。這是因唾液中含有一種消化酵素,澱粉酶,可以催化澱粉的水解,成為小分子的寡醣或麥芽糖。酵素又稱為酶,在生物體內扮演非常重要的角色。舉凡細胞生長週期的調控、代謝反應、訊息傳導、基因的複製、養分的運送及維持細胞生長等重要功能,都需要酵素的參與。酵素催化反應的選擇性高及催化效率佳,它的本質是具有特殊結構的蛋白質,由於酸鹼性及溫度會影響蛋白質的結構,因此酵素催化反應的效率受環境影響很大。本實驗以極為容易取得的唾液澱粉酶,操作簡易及用量少的點滴實驗,探討酸鹼性及溫度對酵素催化效率的影響1-3

n  原理與概念

一、觸媒

化學反應的速率快慢不一,例如:氯化銀之沉澱反應速率很快,但以氮氣及氫氣反應製造氨氣的哈柏法(見式[1]),由於反應之活化能高,於室溫下的反應速率很慢。因此反應過程中常加入適當觸媒以降低反應之活化能、加快反應速率。觸媒又稱催化劑,是一種加到反應系統中,可以參與反應以加快反應速率,而本身不被消耗或轉化的物質。一般依據相態的不同,分為均相觸媒、異相觸媒及生物觸媒(酶或酵素)三大類。以雙氧水的分解反應為例,可以使用均相觸媒KI水溶液、異相觸媒MnO2固體及生物觸媒過氧化氫酶催化分解反應(見式[2]

clip_image002    [1]

clip_image004    [2]

酵素是生物體內之催化劑,一般是由蛋白質所組成,具有特殊的立體結構,對反應受質之選擇性高,且在一般體溫的溫度下就有很好的催化效率,而酵素的催化機制可以鎖鑰模式說明(見式[3])。因此當環境的酸鹼度或溫度改變,酵素的結構發生變化,而影響它的催化效率。

酵素(E+ 受質(S® 酵素受質(ES® 酵素(E+ 產物(P    [3]

二、澱粉酶催化效率測定原理

本實驗使用取自唾液的澱粉酶來催化澱粉水解,成為小分子的醣或麥芽糖。由於澱粉與三碘錯離子(I3,褐色)反應會產生藍黑色的錯合物(見圖一),觀察碘試液顏色的變化,即可判斷溶液中澱粉被澱粉酶催化水解之程度。因此將含澱粉及澱粉酶之反應液滴加到碘試液並混合均勻,反應剛開始時因含有澱粉,因此混合後碘試液呈現藍黑色。隨著澱粉酶催化水解反應之進行,混合液中澱粉含量減少而碘試液逐漸轉為紅棕色。最後當反應液中澱粉完全被水解時,混合液呈現碘試液原有之黃棕色(見式[4])。因此,記錄定量澱粉被完全水解所需的時間(即反應液與碘試液混合,無藍黑色呈現),代表酵素催化反應之速率,水解所需的時間越短者表示酵素的催化效率越高。

clip_image006    [4]

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圖一:澱粉與三碘錯離子形成錯合物

(圖片來源:Starch and Iodine, http://goo.gl/0YHlQ7

n  藥品、器材與材料

一、藥品

每組用量:0.5%氯化鈉 25 mL、碘試液(1% I2 / 2% KI 35 mL2%澱粉溶液 6 mLpH 7緩衝溶液 4 mLpH 5pH 9緩衝溶液 1 mL

二、器材與材料

每組用量:試管(10 mL 10支、試管架 1個、乳帽和玻璃滴管(或塑膠滴管) 2支、燒杯(100 mL 2個、量筒(10 mL1支、漏斗 1支、玻璃棒 1支、刻度吸量管(2 mL1支、安全吸球 1個、保麗龍湯杯(200 mL 2個、溫度計 1個、計時器 1個、碎冰 100 g、投影片及襯墊白紙 1套,如相片一所示。

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相片一:試管和滴管、投影片和襯墊白紙、燒杯、安全吸球和刻度吸量管、計時器以及保麗龍湯杯

三、藥品配製

l  0.5%氯化鈉:秤0.5 g氯化鈉(NaCl)加水至100 g

l  2%澱粉溶液:秤2 g可溶性澱粉以少量水攪拌成乳狀液,沖加熱水至100 g,煮沸後靜置放冷。

l  碘試液(1%I2 / 2%KI):秤1 g碘(I2)及2 g碘化鉀(KI)加水稀釋至100 g

l  pH 5緩衝液:秤14.0 g鄰苯二甲酸氫鉀(KHP)及2.7 g碳酸氫鈉(NaHCO3),加水稀釋至1公升。

l  pH 7緩衝液:1.20 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4)及0.885 g磷酸氫鈉(Na2HPO4),加水稀釋至1公升。

l  pH 9緩衝液:6.2 g硼酸(H3BO3)及38.1 g硼砂(Na2B4O7·10H2O),加水稀釋至1公升。

n  實驗步驟

一、唾液澱粉酶活性測定

1.          洗淨烘乾10支試管,放冷後備用;準備一張「澱粉酶活性測定」投影片及襯墊白紙。

2.        配製唾液澱粉酶溶液:經由漏斗收集1 mL唾液於10 mL量筒中,加入0.5%氯化鈉溶液至量筒10 mL標線處以稀釋唾液,並轉置於乾淨的100 mL燒杯中,再加入15 mL0.5%氯化鈉溶液,以玻璃棒攪拌並混合均勻,此為唾液澱粉酶溶液,如相片二所示

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相片二:配製唾液澱粉酶溶液

3.        準備碘試液:以滴管吸取碘試液,在「澱粉酶活性測定」投影片及襯墊白紙上,於橫向方格內的每格滴入1滴碘試液,預先準備510滴碘試液,如相片三所示

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相片三:於投影片上的橫向方格內滴入碘試液

4.        1 mLpH 7緩衝溶液置於乾淨試管中,再加入1 mL2%澱粉溶液,此為反應試液,如相片四所示

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相片四:反應試液準備於試管中

5.        2 mL刻度吸量管(或有刻度的塑膠滴管)量取2 mL唾液澱粉酶溶液,加入於上述反應試液中,立刻以彈震試管方式或以乾淨之玻璃滴管吸排溶液數次,將溶液混合均勻並開始計時,如相片五所示

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相片五:2 mL刻度吸量管量取2 mL唾液澱粉酶溶液

6.        溶液混合後,立即以玻璃滴管取1滴反應液與投影片上1滴碘試液混合顯色。每隔30秒或1分鐘,取1滴反應液與投影片上碘試液混合,隨時間觀察顏色的變化,直到溶液之藍黑色消失呈現碘試液的黃棕色,如相片六所示

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相片六:觀察顏色隨時間的變化

二、酸鹼性對唾液澱粉酶活性之影響

1.        另取2支試管,分別量取1 mLpH 5pH 9緩衝溶液,並各加入1 mL2%澱粉溶液。重複步驟一之56操作,測定唾液澱粉酶在不同pH溶液中之催化效率,如相片七所示

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相片七:觀察顏色隨時間的變化

三、溫度對澱粉酶活性之影響

1.        2個交疊之保麗龍杯,加入碎冰及少量的水。取2支試管,一支裝盛2 mL唾液澱粉酶溶液,另一支裝盛反應試液(含1 mLpH 7緩衝溶液和1 mL2%澱粉溶液),同時置於約0冰水浴中5分鐘,以溫度計量測反應試液之平衡溫度,如相片所示。

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相片八:冰水浴反應裝置

2.        將唾液澱粉酶溶液倒入反應試液中,迅速混合均勻後將試管置回冰水浴,並立刻開始計時。依照步驟一之56,測定澱粉酶之催化效率;測定過程中同時觀察記錄溶液溫度的變化。

3.        經測定10分鐘後,將反應液試管自冰水浴中取出,儘速回復室溫後,再繼續測定觀察5分鐘。

4.        重複步驟13,但改為置於80以上的熱水50左右的溫水中進行反應。

n  結果與討論

本實驗於臺灣大學普通化學實驗由大一學生實作,發現於pH 7的緩衝溶液中,反應試液與碘試液之呈色反應,從初始含澱粉之藍黑色,至澱粉完全水解後僅呈現碘試液的黃棕色約需時6分鐘;而大部分學生之唾液澱粉酶於pH 7緩衝液中催化水解效率最佳,但也有少部分學生的實驗結果於pH 59的條件效果較好。

唾液澱粉酶於冰水浴中與澱粉試液混合,反應約10分鐘,仍未出現明顯顏色變化,顯示低溫下催化活性降低許多;但復室溫後,澱粉酶會恢復活性,繼續催化澱粉水解,而可觀察到碘試液的顏色變化至呈現黃棕色。若將唾液澱粉酶溶液加熱至80以上時,澱粉酶會完全失去催化活性,縱然回復到室溫,依舊無法催化澱粉之水解。這是由於高溫破壞了唾液澱粉酶的結構,使其失去催化活性。然而,若將反應溫度改變為50左右,唾液澱粉酶不會被破壞,反而會因為溫度較高,而提升水解效率。

學生實驗過程中,我們亦發現上午實驗班級之學生,因多未吃早餐,唾液澱粉酶活性較差,催化水解效率不佳,故建議實驗前先進食,且最好是吃含澱粉的食物。

n  注意事項

l  碘試液必須存放於茶色瓶或於瓶身包覆鋁箔紙以避免照光分解。澱粉溶液需新鮮配製或添加防腐劑,以避免久放後長霉變質。

l  澱粉反應試液應懸空滴下以與投影片上碘試液混合,避免滴管碰觸碘試液而致污染。每次點滴測試,均應重新吸取試管內之反應液。

l  若澱粉酶催化反應速率較慢> 6分鐘),可延長測定觀察時間為每分鐘一次,或可再增加0.51 mL唾液於溶液中以增加酵素濃度。

l  若測試之變色時間短於2分鐘,可再增加510 mL氯化鈉溶液,以稀釋酵素濃度。

n  教學指引

l  本微量實驗可搭配高中基礎化學(三)之「化學反應速率」或大學普通化學實驗之「化學動力學」課程內容,進行實驗印證。

l  於操作實驗之前,教師可先簡述酵素的本質及其催化活性受酸鹼度和溫度的影響,再說明實驗操作與注意事項(參考臺灣大學化學系普通化學實驗的上課簡報,下載檔案在:http://www.ch.ntu.edu.tw/~genchem99/doc/presentation/searching-for-the-champion-of-saliva-zh.pdf),而後讓學生進行分組操作,實驗可於2小時內完成。

l  教師亦可隨實驗時間安排進行部分實驗,例如僅測試溫度效應。或者可先讓學生閱讀相關資料,思考其他可能影響酵素活性之因素,設計延伸實驗,作為一項探索實驗教材。

l  本微量實驗教師所需準備的藥品和器材均容易取得。部分器材可隨學生年級與實驗環境做彈性調整。例如:玻璃滴管可以改為使用塑膠滴管;2 mL刻度吸量管可以改為使用具有粗略刻度之塑膠滴管;投影片可以改為使用白色陶瓷點滴板;可以加熱板加熱水或使用煮沸之熱水等。

l  本微量實驗之「澱粉酶活性測定表」是直接印在投影片上,再襯墊白紙以讓呈色更明顯;實驗後以擦手紙擦拭、清水清洗擦乾後可重複使用。也可將測定表印在白紙上,上方襯墊投影片,唯當移動時可能格位錯置,記錄結果時須小心。

l  本微量實驗讓學生吐出並吸取各人之唾液以配製澱粉酶溶液,吐口水時雖略感噁心尷尬,但經加入0.5%NaCl稀釋後,口水的黏性消失,即可順利完成實驗。

l  學生經由此實驗結果瞭解個別唾液澱粉酶之催化特性,互相比較實驗結果,可以讓學生瞭解生物體之奧妙,增進學習興趣。

n  結語

本實驗是一個有趣且生活化的實驗。學生以簡易、可重複使用的投影片及滴管,進行藥品用量極少的點滴實驗,其中每毫升碘試液,約可進行30滴次試驗。實驗所使用之唾液澱粉酶極易取得,其他所用藥品毒性低,而且廢液可以直接沖洗至水槽,是一個減廢、減量的學生實驗。另外於投影片上進行簡單的實驗測試,藉由澱粉和三碘錯離子的呈色反應可以定量唾液澱粉酶催化水解反應之效率,瞭解生物觸媒的最適作用pH,以及溫度對酵素催化反應之影響。學生還可延伸此實驗至其他影響因素如溶劑、重金屬、殺菌劑等之影響,進一步認識我們生物體中一直在進行各種生化反應

n  參考資料

1.        Enzyme Hydrolysis of Starch, http://faculty.mansfield.edu/bganong/biochemistry/spitlab.htm.

2.        Experiment 10 – Enzymes, http://www.laney.edu/wp/cheli-fossum/files/2012/01/10-Enzymes.pdf.

3.        臺灣大學化學系,《大學普通化學實驗》第14版,民國1049月,臺大出版中心:台北。

n  謝誌

本微量實驗是為臺灣大學暑期化學營的實作實驗而開發,於本校普通化學教學組歷任教師及助教協助下進行修訂與改進,而有各項多媒體教材如教學簡報及網頁教材之呈現,教學資源可參考臺灣大學化學系網頁:http://www.ch.ntu.edu.tw/~genchem99/index.htm

n  學生實驗手冊

下載本微量實驗的學生實驗手冊誰是口水王—酸鹼性和溫度對澱粉酶催化效率之影響

 

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