創意化學實驗:高解析度質譜快速鑑定未知農藥 / 方銘志、蔡佳芬、高雅敏、王德原

星期日 , 8, 七月 2018 Leave a comment

創意化學實驗:
高解析度質譜快速鑑定未知農藥

方銘志*、蔡佳芬、高雅敏、王德原

衛生福利部食品藥物管理署
*
fangmc@fda.gov.tw

n  前言

未知物的分析如同尋寶一般,憑著一絲線索逐步發掘更多的線索,最後一步步、一塊塊得拼湊出未知物的樣貌,其過程有如大海撈針,充滿著冒險與挑戰。過去一項未知物質的鑑定工作,從找出可疑訊號開始,歷經可疑物質純化分離,最後面臨其結構鑑定與確認,所需要的時間至少超過半年甚至更久;而隨著現代質譜科技的進步,本文藉由二個不明粉末鑑定的實際案例,利用高解析度質譜逐步推敲出未知物質的結構,最後確認為違法的新興農藥,整個過程所需時間僅數星期,文中以化學元素精確分子量及元素間穩定同位素比例的觀念,快速解析出未知物質,是化學元素基礎理論實際應用的優良實例,現代化高解析度質譜是鑑驗一大利器,搭配專業人員的化學知識得以搭建高效率檢驗圍籬,阻絕危害物質進入國內,維護國民健康。

n  質譜儀

三稜鏡用於光的色散,可以把一束白光分出七彩,而這一道道不同顏色的光,是不同波長的光線因折射率不同,而在折射時偏轉不同角度,稱為光譜(spectrometry)。質譜(mass spectrometry)意思就是質量(mass)與光譜,原理亦如三稜鏡般,但不同的是使用磁場或是電場代替稜鏡,而帶電物質會因為其質量大小而影響其在磁場或是電場偏移的角度,因此能把物質依質量大小分開,也可以叫做質量分析器,可以想像質譜儀是一個秤,可以秤量化學分子的質量,解析度高的質譜儀可以量測質量至很精準的地步,如小數點下第四位統一原子質量單位(Unified atomic mass unit, u),這時就可以輕易地分辨出例如水(H2O=18.015 g mol-1)和銨(NH4+=18.038 g mol-1)整數質量(Nominal Mass)同為18的兩個不同物質。利用高解析度質譜儀能幫助我們以較少的樣品量與較快的速度,鑑定出未知物質的化學元素組成。

n  不明粉末成分鑑定

近年國際快遞頗為流行,著名的國際購物網站如Amazon、淘寶等林立,我們只要在手機或電腦前按幾下,商品就會送到家門口,頗有貨暢其流寓意,去年2017年海關簡易進口數量就超過三千萬件,平均每位國民都有買超過一件以上的國際快遞物品,但這條路線卻也成為違法進口的康莊大道,不時可以在電視及網路媒體新聞上見到不肖業者利用國際快遞郵包,夾藏毒品、化學物質、藥物等,利用迂迴郵寄路線,增加查緝難度,使得多種化學物質在無人知曉的狀況,偷偷的進入國內,嚴重危害國民健康。

二件關務署送驗的未知粉末,其中一個是重達20公斤的國際快遞郵包,申報名稱為material,但實際上為黃色粉末物,貨品與名稱不符,遭關務署查扣,這件可疑的未知黃色粉末(見圖一左),經過一般例行性檢驗後,結果為未檢出現行檢驗方法列出之農藥有效成分,由於仍不知是什麼物質,於是輾轉送到食品藥物管理署檢驗。另一件是外觀類似水泥的細粉,顏色為白色(見圖一右),也是國際快遞郵包遭攔截,經例行性毒化物檢驗後,結果也為農藥未檢出。這二件檢體,經初步的溶劑萃取與層析分離後,可疑的訊號以高解析度質譜分析,能快速拼湊出未知物質的化學元素組成。但事實上未知物質的檢驗,在以儀器分析前的樣品處理步驟,才是最難的地方,因為不知道它是什麼成分或組合的物質,需要憑經驗嘗試許多不同的參數,例如:不同極性的溶劑、酸鹼值調整及溶劑間的分配率等一試再試,最後才能萃取出有代表性的檢液;而以層析方法初步分離未知物質後,還要能幸運的挑出可疑訊號,若挑出的訊號只是不純物而不是想要分析的未知物,只能回頭再重來一次,但既然是未知物,就什麼都有可能,這挑出可疑訊號的過程猶如大海撈針,在實務上比我們接下來要談的如何利用高解析度質譜快速鑑定未知物的結構還難呢!以下二張圖就是這二個未知物以高解析質譜儀分析的質譜圖,圖2是不明黃色粉末之質譜圖,圖3則為不明白色粉末之質譜圖。我們之前談論過質譜儀好像是一個秤,可以秤出分子的質量,那也許你會問為什麼圖一的黃色粉末經質譜儀分析後得到的結果竟有至少4個不同的質量,其實這四個質量都來自同一個未知物,原因是自然界存在天然同位素。

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1:可疑的未知黃色粉末(左)和外觀類似水泥的白色細粉(右)

2018-07-31_213633

2:不明黃色粉末之高解析質譜圖

2

3:不明白色粉末之高解析質譜圖

n  同位素是甚麼?可以幫助預測分子元素組成?

我們知道有機物質主要由碳、氫、氧、氮及硫組成,有時還含有鹵素,在自然界天然存在著同位素,他們的質量及在自然界中的比例如表1所示。如果一個有機分子裡所含的元素全都由自然界豐量最高(most abundant)質量的元素組成,稱為單一同位素(monoisotope),但事實上因自然界存在著同位素,因此所有有機物質均有同位素。以一個簡單的分子「苯」舉例來說,苯的化學式是C6H6,一般我們在算分子量時都使用整數,因此苯的分子量約為12clip_image0146 + 1clip_image0146=78(g mol-1)。如果參考表1算得仔細一點為12.000000clip_image0146 + 1.007825clip_image0146 = 78.04695 (g mol-1)。如果上網(例如:Wikipedia)查尋苯的分子量(或稱莫爾質量),則我們得到數字卻是78.11g mol-1,為什麼上網查得78.11g mol-1而我們自己查表算的確是78.04695g mol-1呢?原因是我們在計算時沒有考慮到同位素,我們只計算分子量最小的分子,事實上苯分子上碳有可能被碳1313C)所取代,而這個含有1個碳13的苯分子質量就會變成79.0503 12.000000clip_image0145 + 13.003355clip_image0141 + 1.007825clip_image0146(g mol-1),這個比較重的苯出現機率還蠻高的喔,超過6%,利用數學課裡曾教過的排列組合,我們可以計算出來,如果含6個碳的苯其中1個碳是碳13的機率,那就是從6個碳裡取1個出來的機率,數學式為clip_image0160.0111clip_image0140.9895= 0.0624 clip_image018 6%,意思就是1個碳135個碳12的機率(0.0110.989分別為碳13和碳12在自然界中出現的機率,可以由表1中得到),因此如果以高解析質譜來分析苯,它的質譜圖會如圖4所示,至少可以看到3種苯分子的同位素組成,分別是質量為787980的三種苯同位素,而一般我們所使用的莫爾質量就是平均分子量,是計算苯所有同位素的算術加權平均分子量,算法如表2所示:

1:常見元素之質量及在自然界之比率

 

M

M+1

M+2

元素

 

質量

比例

 

質量

比例

 

質量

比例

1H

1.007825

99.985%

 

 

 

 

 

 

12C

12.000000

98.9%

13C

13.003355

1.11%

 

 

 

14N

14.003074

99.6%

15N

15.000109

0.37%

 

 

 

16O

15.994915

99.8%

 

 

 

18O

17.999160

0.2%

32S

31.972072

95.0%

33S

32.971459

0.76%

34S

33.967867

4.3%

35Cl

34.968853

75.8%

 

 

 

37Cl

36.965903

24.2%

79Br

78.918338

50.7%

 

 

 

81Br

80.916291

49.3%

2:計算苯所有同位素的算術加權平均分子量

同位素

分子式

質量

比例

貢獻度

M

12C6H6

78.0464

93.57%0.9896

73.0349

M+1

13C12C5H6

79.0503

6.24% clip_image0200.0111clip_image0220.9895

 4.9361

M+2

13C212C4H6

80.0537

0.17% clip_image0240.0112clip_image0220.9894

 0.1390

 

 

 

平均分子量

78.11

3

4:苯的高解析質譜圖及其同位素組成

現在我們可以開始來利用某分子的同位素組成,推測它可能含有的元素比例,第一個未知物的質譜圖(見圖2)告訴我們這個未知物的精確分子量為271.09531g mol-1,這個數字是該未知物因以電灑游離法分析,其單一同位素分子上多了一個氫離子,呈正1價的帶電狀態(M+H+),我們在分子量約增加1處(272.09848)也可以看到一個訊號,這是該未知物的M+1,以此類推,M+2M+3也都看得到,而M+1多半由碳13所貢獻,因為常見主要元素中會對M+1有貢獻的元素只有碳、氮及硫而已(見表1),而碳在自然界中的比例又較其他二者氮及硫為高,且有機物幾乎都含有碳。我們從圖2中可以看出當M的數量為100時,M+114,所以M+1M的比例約為12% [14/(14+100)=0.122],若該未知物含有n個碳,則該未知物M+1的比例應為clip_image0330.0111clip_image0140.989n-1,而clip_image035=n,若將0.989n-1當成1時該數學式則可化簡為:M+1的比例%=nclip_image0140.011,所以n= (M+1的比例)/1.1,我們已經從質譜圖中得知該未知物的M+1比例為12,因此可以推測該未知物含有11個碳原子(12/1.1clip_image03711)。同理該未知物的M+2有將近25%,從表1中可以知道,會對M+2有貢獻的有機元素只有氧18、硫34、氯37及溴81,只有含1個氯合理,因此憑藉質譜圖,我們已經可以得到多項未知物的資訊如:精確分子量為271.09531、含有11個碳及1個氯。

另一個未知白色粉末的質譜圖如圖3所示,顯示未知化合物之單一同位素精確分子量為529.9550 M+H+),數量最高的同位素是M+2處的同位素(m/z 531.9524),其次則是M+4處(m/z 533.9495),這種奇怪的組成是因為該未知分子含有鹵素,因為鹵素同位素在自然界的比率都很高,可以由表1中看到,我們推測其元素組成一定含有多個氯及溴,因為氯或溴主要只有M+2n同位素,而此未知化合物之MM+2M+4M+6的量在圖2中分別為501006520,因此MM+2M+4M+6之相對比例則分別為21%42.5%27.6%8.5%,相對比例之計算方式以M處同位素為例,M% = 50/(50+100+65+20) × 100% = 21%M+8因為太小所以忽略不計)。

我們要推測該未知化合物分子式中氯或溴的可能數量,讓我們先猜猜如果該未知物含有1個溴和2個氯,那該未知物的質譜圖中M+2之比例應該要是47.7%,算法是因為1個溴和2個氯中只有1個同位素,所以可能組合是81Br35Cl2(溴為較重同位素)+ 79Br37Cl35Cl 1個氯為較重的同位素),數學式則為clip_image0390.4931clip_image0410.7582 + clip_image0390.5071clip_image0430.7581×0.2421 = 0.477,這與圖3中的實驗值42.5%並不相符。那我們再試試,如果該未知物含有1溴和3氯,其M+2之比例則會是42.6%,因為1溴和3氯中只有1個是同位素,可能組合是81Br35Cl3 + 79Br37Cl35Cl2,數學式為clip_image0390.4931clip_image0450.7583 +clip_image0470.5071clip_image049 0.2421 clip_image014 0.7582 = 0.426,這與實驗值42.5%相當接近,所以該未知物可能含有1個溴和3個氯。我們可以再算一算M+4的比例來做第二次確認,如果1個溴和3個氯中有2個同位素時可能組合為81Br37Cl35Cl2 + 79Br37Cl235Cl,數學式則為clip_image0390.4931clip_image0490.2421 clip_image014 0.7582 +clip_image0470.5071clip_image051 0.2422 clip_image014 0.7581 = 0.273,這與實驗值27.6%也很接近。另外,該未知物含有的碳數量為19個,因為我們從圖3中計算M+1M的比值約為20%,因此20/1.1 clip_image018 19。最後我們得到這個白色未知粉末的資訊為:精確分子量529.955g mol-1,含有1個溴、3個氯及19個碳。

n  質量能秤得多精準

從表1中我們可以看到,除了碳12的原子量是12.000000為整數之外,其他的元素都不是整數,這是國際原子量委員會(International Committee on Atomic Weights,ICAW)決定以碳-1212C)為原子量的比較標準,其他元素的質量都是和碳-12來比較。可以看到各元素的原子量都接近整數,但均有小數點以下位數之數值。讓我們再看一次黃色未知物的質譜圖(圖2),M+1M之間的距離,事實上就是碳-1313C)和碳-12同位素之間的差,不難理解M+1是因為該未知物分子裡其中1個碳-12被碳-13所取代,因此,M+1M之間的距離可以算出是13.003355‒12.000000=1.003355,讓我們把圖2中的M+1訊號放大來看如圖5所示,我們發現M+1的訊號其實不只是只有1個分子,分子量272.09848代表的是該未知物分子中有1個碳-12被碳-13所取代,那它之前的那一個小訊號272.09311是甚麼呢?它只會是含硫-3333S)或是氮-1515N)的同位素,如果是硫的話(意思是該未知物含有硫元素,而且其中1個硫-3232S)被硫-33所取代),那它應該在距離M 0.999387處有訊號(33S‒32S = 32.971459 ‒ 31.972072)。事實上,我們在圖5中並未見到,因此可以推測該未知物的組成沒有硫元素。那這個小訊號一定是氮嗎?我們可以算算看,若該未知物含有氮,且分子中有1個氮被氮-15所取代,它的重量應該會增加15.000109 ‒ 14.003074 = 0.997035,因此會在距離M+1左邊約0.0063 u處有1個小訊號,實際上我們也在圖5中見到了(圖5中二個訊號的距離約0.0054 u,雖然有誤差,但可以明顯判別該訊號非硫所貢獻,所以一定是氮),而這個訊號的比例約為1.5%,再由表1中得知氮15在自然界中的比率為0.36%,因此clip_image0530.00361clip_image014 0.993n-1=1.5%,可以化簡為nclip_image0550.36=1.5,所以nclip_image0374,因此我們又得到另一個有關該未知物的資訊就是它還含有4個氮。綜上所述,如果質譜儀的解析度可以區分小數點以下4位的u,我們可以快速的解開未知物質的元素組成,這就是拜現代高科技之賜,然而從此例中也可以知道目前所使用的最高階儀器仍有誤差,需引進更高解析度的質譜儀,方能以科學證據,持續防杜不法。

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5:黃色未知物之M+1高解析質譜圖

n  未知農藥結構快速鑑定

使用高解析質譜儀,我們得到黃色未知物之資訊為C11HxOyN4Cl+H+=271.09531XY雖為未知,但因H=1.007825O=15.994915,要與該分子量的小數位0.09531符合,因此唯一可能的組合為15H2O,所得到的化學式為C11H15O2N4Cl,這個未知物被解出來是烯啶蟲胺(Nitenpyram),並透過和標準物質比對後確認。烯啶蟲胺是動物用殺蚤劑,但不得使用於供作人類食用之動物身上,烯啶蟲胺的化學結構和前一陣子雞蛋中芬普尼殘留事件的主角芬普尼(Fipronil)相似。由於無法於一般例行性檢驗中被檢測出來,若於市售肉品、蛋品中發現,即為違法使用,所幸有被查緝攔阻。

另一白色未知粉末經試驗後所得到的資訊為C19HxNyBrCl3Oz+H+=529.955,唯一的可能組成為C19H15N5BrCl3O2,得到國際純化學暨應用化學聯合會(InternationalUnion ofPure andAppliedChemistry, IUPAC)名為3-bromo-1-(3-chloro-2-pyridinyl)-N-[2,4-dichloro-6-(isopropylcarbamoyl)phenyl]-1H-pyrazole-5-carboxamide的化合物,結構如圖6所示。雖然此化合物並沒有商業化標準品,無法以標準品進一步比對,但是以質譜碎片和核磁共振光譜(NMR)可加以確定無誤。有趣的是該粉末竟為一種名為氯蟲苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)農藥的結構類似物,從圖6中可以看出它們之間的不同處和相同處,這是化學家刻意合成的農藥結構相似物,屬於新興農藥,由於這種新合成的農藥結構相似物無法於例行性農藥殘留檢驗中被發現,如被不肖者使用於農產品、有機食品、無毒食品中,將能僥倖逃過檢驗,所幸被查緝出並無流入市面。未知物檢驗的挑戰度高,隨者科技不斷的進步,很多未知物終將漸漸被發現而成為已知物,但也不斷有未知物被合成及使用。

 

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6:農藥氯蟲苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)和白色未知粉末的結構

n  參考文獻

1.      週期表上原子量的數字即將有所更動,http://case.ntu.edu.tw/magichem/blog/?p=1168.

2.      Table of isotopic masses and natural abundances, https://goo.gl/M6HfmS.

3.      Unified atomic mass unit, https://en.wikipedia.org/wiki/Unified_atomic_mass_unit.

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