臺灣化學教育

奈米/團簇實驗課程設計與應用:

奈米好好玩－簡易螢光金奈米團簇製備及重金屬汞離子檢測應用

謝佶霖、林穎巧、鄭碧雲、林泱蔚^*

國立彰化師範大學化學系

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• 摘要

本實驗主要介紹螢光金奈米團簇的合成與其重金屬檢測的應用。第一部分以家用微波爐進行微波反應，利用雞蛋白做為板模及保護劑，並且以蘇打維持鹼性環境，雞蛋白中胺基酸(色胺酸及酪胺酸)就能將金離子還原成具有螢光性質的金奈米團簇。合成條件以雞蛋白及蘇打做反應試劑，搭配家用微波爐加速反應(反應時間5分鐘)，故符合綠色化學的原則。使用370nm為激發波長，雞蛋白–金奈米團簇會放出紅色螢光(波長為646nm)，並計算雞蛋白–金奈米團簇的量子產率為2.3%。第二部分將雞蛋白–金奈米團簇與不同的重金屬離子混合，可觀察因為Hg²⁺-Au⁺間之金屬親核鍵結的關係，發現只有汞離子能使雞蛋白–金奈米團簇的螢光產生消光反應。利用此機制檢測汞離子，其最低檢測濃度為5.0mM。本篇研究發展出來的螢光金奈米探針具有簡單、快速合成、高選擇性及對環境友善的優點，非常適合發展於高中及大學階段之基礎實驗，使高中生及大學生能瞭解奈米科技在生活上之應用。

一、前言

奈米材料因有別於塊材的物性以及化性，導致其成為學者主要研究對象。近年來，金奈米團簇(gold nanocluster, AuNCs)的合成與應用則被廣泛地關注及討論。金奈米團簇是粒徑小於2 nm的金奈米材料，通常是由數十至數個金原子所組成。和金奈米粒子相比較，金奈米團簇在暗室下受紫外光的照射會顯現出其螢光性質，呈現橘紅色的螢光。其原因為金奈米團簇的量子效應所致，即當物質的大小縮小至奈米尺度範圍時，其物理性質或化學性質會產生重大改變，能階狀態也會從連續態轉為不連續態。因此，金奈米團簇經紫外光激發後，電子會由基態躍遷至較高的能階(激發態)，經過內轉換後，電子會先下降至較低的能階，最後再降至基態並放出能量，放出能量的形式為產生橘紅色的螢光。此具螢光特性之金奈米團簇將可發展成生物探針、細胞標定試劑與重金屬離子感測器。

金奈米團簇的製備方法多樣化，包括(1) 化學還原法：直接加入強還原劑(硼氫化鈉)至金離子溶液中，使正三價金離子還原成正一價金離子與金原子，再組裝成金奈米團簇。然而此方法所需反應間較長，且需加入強還原劑，對環境不友善。(2) 微波輔助法：為縮短反應時間、加熱及粒子大小均勻性，可透過電磁微波方式，使溶液分子極化震盪摩擦，進而使反應溶液加熱。因此，奈米材料之製備會使用微波輻射方式輔助合成。(3) 超聲波合成法：在反應溶液中施加高強度之超聲波，使溶液不斷產生氣泡生成及崩解現象，進而在溶液環境中產生如剪切力及衝擊波等物理作用力，幫助化學反應進行。其優勢為反應速率快與粒子粒徑均勻，然而受限於反應過程中所造成的噪音污染及易生成副產物。(4) 光化學還原法：利用高能量紫外光照射反應溶液，產生高還原能力之自由基，進而產生還原反應。此方式具備合成簡單、成本低及低毒性之優勢。但是，粒子粒徑均勻度不佳。(5)核心侵蝕：在金奈米粒子溶液中，加入硫醇分子等氧化劑，使其形成可溶性之金–硫小分子達到縮小原本尺寸的效果。此方式缺點為氧化侵蝕反應往往耗費時間，且粒徑大小不均勻。(6)模板輔助法：利用蛋白質及胺基酸等生物分子作為金奈米團簇生長的模板，提供良好的生成骨架，使金原子能穩定組裝成長。此合成方式簡單，常使用一鍋反應合成法進行製備。由於金原子穩定成長及鑲嵌在生物分子中，故無需再添加保護劑。

二十世紀中葉，汞金屬對於環境污染開始廣泛被世人所重視，起因於日本熊縣水俁市所發生的集體汞中毒事件，造成重大的人員傷亡、後遺症及環境汙染，成為日本四大公害病之一，後人稱「水俁病」。無機汞會經由環境中的微生物作用轉變成毒性較高有機汞，藉由食物鏈累積於較大型的動物體內，進而被人類攝取，影響中樞神經或其他器官的運作，如肝臟、腎消化系統，對人體造成不可逆損害。美國國家環境保護局規範，飲用水中的汞含量不可以超過2 ppb (10 nM)，於工業用水中則不能超過 50 ppb (250nM)；歐盟規範飲用水中的汞含量不可以超過1 ppb (5 nM )；美國食品與藥物管理局則規定海鮮中的汞濃度最大上限為1 ppm (5 mM)。現今在檢驗上，使用高效液相層析質譜儀、感應耦合電漿/質譜儀與原子吸收光譜儀等分析儀器來檢測汞金屬，但上述的測量方法受限於設備昂貴、樣品前處理複雜、檢測時間較長，無法即時地檢測，所以開發簡單且能快速偵測汞金屬離子之感測器是必需。

近年來，有關金奈米團簇的研究議題吸引了許多學者的關注並致力於相關的發展。因為金奈米團簇擁有螢光特性、製備簡單、與水溶液有較好的相容性與毒性較低等優點。但綜觀不同單位的研究，大多都有添加對環境較不友善的強還原劑，或者使用經純化的蛋白質作為合成板模，如牛血清蛋白、溶菌酶或人血清白蛋白等，使得金奈米團簇的製備成本提高且較不符合綠色化學的原則，所以本文希望能使用雞蛋白取代經純化後的蛋白質來降低金奈米團簇的合成成本，並結合家用微波爐輔助進行加熱，加快反應速率及縮短合成時間，取代昂貴的微波輔助反應器，來降低整體材料的製備成本，開發具選擇性、綠色、低毒性的螢光感測器。另外，我們以金奈米團簇當做螢光探針來檢測重金屬汞離子。由於Hg²⁺與Au⁺在電子殼層間的d¹⁰軌域中會形成作用力強的金屬親核鍵，此鍵結會影響受紫外光激發的電子躍遷情形產生消光現象，達到定性定量之效果。因此，本文重點將包含：(1)學習以雞蛋白、碳酸鈉、四氯金酸與微波爐進行綠色化學合成法，合成螢光金奈米團簇。(2) 比較不同重金屬離子對螢光金奈米團簇之影響，並探討其選擇性及靈敏度。希望本文能提供高中及大學階段之基礎實驗，使高中生及大學生能以動手做實驗方式，瞭解奈米科技在生活上之應用。

二、實驗方法

1.        藥品

所有藥品皆為分析等級未經任何純化處理。四氯金酸、碳酸鈉、氯化汞、硝酸鉛、硝酸鎘、硝酸鎳、氯化鋇、氯化鈣、氯化鈉、硝酸鍶、硝酸鎂、氯化鐵、氯化亞鐵、硝酸銅及碳酸鈉皆購買於Sigma Aldrich。三羥甲基胺基甲烷、鹽酸及核黃素-5’磷酸鹽分別購買於JT-Baker及Acros。新鮮雞蛋購買於當地商店。所有水溶液皆以去離子水當做溶劑進行調配至所需要濃度。 

2.        器材

取一顆新鮮的雞蛋，首先分離雞蛋白及蛋黃。再將雞蛋白置於大樣品瓶中，在樣品瓶中放入磁石並置於磁石攪拌器上，以650 rpm攪拌20分鐘，便完成雞蛋白的前處理。取經前處理的雞蛋白500 mL、去離子水1500 mL與0.6 M碳酸鈉100 mL搖晃均勻後，再加入10 mM四氯金酸500 mL，封上保鮮膜，戳一小洞放置於燒杯中，再封上保鮮膜，以低火（功率為120 W）微波兩分半鐘、間斷兩分鐘，再微波兩分半鐘，便完成金奈米團簇的合成。再以17000 rpm 離心30分鐘去除溶液的雜質，以利後續實驗。藉由攜帶式紫外光的照射，清楚看見金奈米團簇溶液呈現淡粉紅色的螢光。利用螢光光譜儀 (激發波長：370 nm) 可測得550－800nm有螢光放光波段。

雞蛋白–金奈米團簇的量子產率計算方式是利用核黃素-5′-磷酸鹽做為比較標準品，其量子產率為26％。實驗方法為分別測量五種不同濃度的雞蛋白–金奈米團簇與核黃素-5′磷酸鹽的螢光光譜 (激發波長：370 nm，放光波長：470－780 nm) 及吸光強度(400 nm)。為避免自吸收，維持吸光強度 (400 nm) 的數值小於0.1。以波長為400 nm的光強度與螢光光譜放光波長470－780 nm的積分面積作圖，計算出線性關係，將兩者的斜率做比較，便可求得雞蛋白–金奈米團簇的量子產率。

4.        雞蛋白–金奈米團簇在重金屬離子檢測應用

配製10 mM不同金屬鹽類的金屬離子溶液，分別為：鈉離子、鎂離子、鐵離子、亞鐵離子、鈣離子、銅離子、鎳離子、鉛離子、鎘離子、鋇離子、鍶離子及汞離子。依序取0.1 mL不同金屬離子溶液加入由0.1 mL的100 mM Tris-HCl (pH9.0)的緩衝溶液與雞蛋白–金奈米團簇(0.7 mL)所組成的混合溶液，充分搖晃反應5分鐘，使溶液均勻混合後再利用螢光光譜儀測量螢光強度。

配製0.1 M的Hg²⁺溶液並用超純水稀釋成濃度10－1000 μM。依序取0.1 mL不同濃度的Hg²⁺離子加入由0.1 mL的100 mM Tris-HCl (pH 9.0)的緩衝溶液與雞蛋白–金奈米團簇(0.8 mL)所組成的混合溶液，充分搖晃反應5分鐘，使溶液均勻混合後再利用螢光光譜儀測量螢光強度。

三、結果與討論

在四氯金酸的還原反應中主要會形成粒子與團簇兩大類。以金奈米粒子為例，主要是利用檸檬酸鈉還原四氯金酸的金離子形成金奈米粒子，可藉由不同反應條件製備出不同尺寸的金奈米粒子，如13nm及32nm 金奈米粒子。金奈米粒子廣泛應用於生物醫學或分析檢測。團簇是介於分子、原子與物質間的過度狀態，性質不同於原子分子，也不同於物質，是以穩定且獨特的狀態存在，且會因尺度大小的不同而改變，本文即是以金奈米團簇為主要探討對象。

在本實驗中，金奈米團簇是於鹼性的條件下藉由微波爐輔助的方式製備合成。利用四氯金酸與雞蛋白並加入碳酸鈉維持弱鹼的環境，再配合家用微波爐的使用，製備出金奈米團簇。雞蛋白在反應中作為模板及保護劑，其所含的色胺酸與酪胺酸在鹼性條件下可將四氯金酸所提供的Au³⁺還原成Au⁰及少部分的Au⁺，雞蛋白的黏稠性能將金原子(Au⁰)聚集成小單元，並於單元外附著少量Au⁺，其雞蛋白的立體障礙又能防止過多的金原子(Au⁰)聚集，控制金奈米團簇為適當的大小，同時雞蛋白所含的蛋白質能藉由凡得瓦力穩定吸附在金奈米粒子表面上作為保護劑維持金奈米團簇的穩定性。

在圖一吸收光譜圖及螢光光譜圖中，可以觀察出雞蛋白–金奈米團簇於可見光波帶並無明顯的吸收峰，且溶液（圖一附圖）呈現深黃色。相較於金奈米粒子因為表面電漿共振的原因，於～520nm的波段有明顯的吸收特徵峰，溶液顏色成紅紫色。於螢光光譜中，可以發現雞蛋白–金奈米團簇是具有螢光特性的物質，其激發波長為370nm，最大放光波長為646nm，為淡粉紅色的螢光（圖一附圖）。雞蛋白–金奈米團簇的螢光特性來自於本身極小的尺寸，以致產生像分子般的HOMO－LUMO電子能階，使得電子能在能階躍遷，進而放出螢光。另外，螢光性質與雞蛋白–金奈米團簇表面附著的配位基團與穩定分子也有強烈的關係，電子可能會從富含硫原子的配位基團傳遞至雞蛋白–金奈米團簇的金核中；或者多電子的配位基直接將電子捐獻給雞蛋白–金奈米團簇的金核中，使得電子能夠在能階當中躍遷，產生螢光的特性。

利用量子產率為26%的核黃素-5′-磷酸鹽作為標準品，來量測雞蛋白–金奈米團簇的量子產率。分別測量五種不同濃度的雞蛋白–金奈米團簇與核黃素-5′磷酸鹽的螢光光譜（激發波長：370 nm，放光波長：470－780 nm）及吸光強度（OD：400 nm）。以波長為400 nm的光吸收強度與螢光光譜放光波長470－780 nm的積分面積作圖，計算出線性關係，將兩者的斜率做比較，可求得雞蛋白–金奈米團簇的量子產率約為2.3%。

圖一、雞蛋白–金奈米團簇之吸收光譜及螢光光譜，且最大螢光放光波長為646 nm；左上角的附圖為照射手提式紫外光前後的照片(激發波長為370 nm)。

進一步，我們藉以螢光的特性來檢測重無機汞離子，由於Hg²⁺與Au⁺在電子殼層間的d¹⁰軌域中會形成作用力強的金屬親核鍵，此鍵結會影響受紫外光激發的電子躍遷情形，阻礙激發態的產生，而產生消光現象。欲了解雞蛋白–金奈米團簇對汞離子的偵測專一性，在雞蛋白–金奈米團簇溶液中，分別加入鈉離子、鎂離子、鐵離子、亞鐵離子、鈣離子、銅離子、鎳離子、鉛離子、鎘離子、鋇離子、鍶離子及汞離子，且加入Tris－HCl緩衝溶液(pH
9.0)做為檢測條件。在圖二的附圖中可以發現，只有汞離子能使雞蛋白–金奈米團簇產生明顯的消光反應，其溶液顏色在手提式紫外光的照射下呈紫紅色。

圖二、雞蛋白–金奈米團簇加入不同金屬離子的照片。汞離子濃度為1.0 mM；其金屬離子濃度則為10.0 mM (激發波長為370 nm)。

最後，針對雞蛋白–金奈米團簇對汞離子的偵測靈敏度做探討，在雞蛋白–金奈米團簇溶液中加入不同濃度的汞離子溶液，由圖三可以觀察到隨著添加的汞離子溶液濃度越大，其雞蛋白–金奈米團簇溶液的螢光強度削弱程度也隨之增大，可由此計算出雞蛋白–金奈米團簇偵測汞離子的最低偵測極限為5.0 mM。

圖三、不同濃度的汞離子溶液對於雞蛋白–金奈米團簇所造成的螢光消光圖。附圖為雞蛋白–金奈米團簇加入不同濃度汞離子溶液（5.0－100 mM）的照片。

四、結論

本文成功利用成本低廉且來源容易取得的雞蛋白取代經純化的蛋白質，並結合家用微波爐提供均勻的加熱五分鐘，便能合成出雞蛋白–金奈米團簇。此雞蛋白–金奈米團簇可以作為汞離子偵測探針，最低可以偵測到濃度為5.0 mM。本合成方法的優勢包括：(1)低成本：合成過程無須利用昂貴的微波合成儀器，且合成材料也無需使用較昂貴的蛋白質來源。僅使用雞蛋白、蘇打及家用微爐，即可合成出具有螢光特性的雞蛋白–金奈米團簇。(2)節省時間：本實驗合成的反應時間因配合家用微波爐的使用只需五分鐘，另外偵測重金屬離子所需的反應時間也只要五分鐘，所以具有合成與偵測快速的優點。(3)綠色合成方法：本實驗使用家用微波爐微波輔助的合成方式來增加反應率，對環境汙染較低的雞蛋白作為還原劑與保護劑，及使用蘇打取代強鹼氫氧化鈉調控合成環境，符合綠色合成方法準則。(4)即時性偵測：可以透過肉眼就可以辨別螢光的顏色，可以作為初步判別汞離子於水樣中的濃度，可即時應用於採集水樣的現場。故本教材非常適合用來對於高中生及大學生進行奈米科技的動手做教學(附錄為本文之教師及學生手冊)。未來希望對此雞蛋白–金奈米團簇進行更進一步研究，提高對汞離子的偵測靈敏度，且將其延伸應用於生物成像、藥物載體以及抗菌實驗等面向，利用其優勢發展更全面性。

補充資料：

微波輔助綠色合成法製備螢光金奈米團簇與其重金屬汞離子檢測應用之教師手冊（附件一）及學生手冊（附件二）。

致謝：

本研究經費補助來自於臺灣科技部合約編號(MOST 107-2515-S-018-002)及(MOST 107-2514-S-018 -005)。

五、參考文獻

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6. Xie, J., Y. Zheng, and J.Y. Ying, Highly selective and ultrasensitive detection of Hg²⁺based on fluorescence quenching of Au nanoclusters by Hg²⁺-Au⁺interactions. Chemical Communications,
2010. 46(6): p. 961.

• 教師手冊（附件一）
• 學生手冊（附件二）