臺灣化學教育

綠色化學:植物色素分離與鑑定

洪敬明^1,*、徐碩志²

無界塾實驗教育機構¹

臺北市立中崙高級中學²

*[email protected]

• 簡介

萃取是高中化學所提及的一種混合物分離技術。過去教師在教萃取時常常以「從碘液中萃取碘分子」的實驗為例，跟同學介紹萃取的原理。然而，這個實驗涉及了，的平衡反應，對於高一同學較為困難；加上實驗後產生的有毒碘廢液需要以硫代硫酸鈉()或氫氧化鈉()處理後，方可以大量清水稀釋後排放。

圖1：碘萃取實驗(左)與植物色素分離實驗(右)的成品比較圖

本教案以生活中常見的植物－鴨跖草為主角，透過淺顯易懂的萃取原理，有效分離植物中的葉綠素與花青素，藉由明顯的顏色變化，讓學生可以理解天然色素的組成與分離的技巧。本實驗當中，非極性層內的混合物，主要是葉綠素與葉黃素，可利用色層分析法進行分離；而極性層中的產物主要是花青素，可作為酸鹼指示劑。

 

圖2：紫竹梅(鴨跖草科)(鄒語騏 攝)

花青素與葉綠素分離實驗的成品非常美麗，可有效吸引學生的目光，提升探究化學的興趣；實驗所需的器材簡易、藥品安全，且容易操作，方便教師準備課程。此主題涵蓋生物與化學，生物可朝植物微觀結構和光合色素功能發展，化學則可討論混合物分離時的交互作用力與動態過程；延伸的建議課程涵蓋了物質與能量、系統與尺度、構造與功能、改變與功能和交互作用等自然領域的跨科概念，可作為跨科課程的主題。本實驗採用天然植物取代有毒的碘化物的使用，實驗後的產物可繼續做為其他實驗使用；極性層的葉綠素與極性層的花青素皆可被陽光自然降解，減少產生廢棄物，符合綠色化學原則。

圖3：鴨跖草下表皮的顯微影像，葉綠體中的葉綠素(左)與液胞中的花青素(右)

• 教學目標

教師能根據教學需求進行數個教學活動，實驗可連結高中化學中的數個主題(混合物分離、物質鑑定原理、指示劑、極性、理想溶液)，也可以訓練學生進行探究與實作活動時的基本技能(問題拆解、資料查詢、建立實驗表格、排序、實驗操作、邏輯判斷等)。

圖4：學生根據自己所建立的物質互溶表排列各溶劑之極性大小

• 藥品與器材

一、器材：

7mL樣品瓶、塑膠滴管、濾紙、抽濾設備、3in1驗鈔筆(白光、紫光、紅光雷射)、咖啡攪拌匙。

二、藥品：

水、乙醇(95%)、丙酮、乙酸乙酯、石油醚(可用正己烷或去漬油代替)、檸檬酸(可用固體或1M溶液)、碳酸鈉(可用固體或1M溶液)。

• 實驗步驟

一、   葉綠素與花青素分離：

1.             取約5平方公分的鴨跖草置於研缽中，加入3毫升的溶劑(酒精或水)後研磨搗爛。

圖5：取鴨跖草加入溶劑後搗爛

2.             組裝濾瓶與抽濾漏斗，用橡皮管連接抽濾瓶與水幫浦，進行減壓抽濾。

 

圖6：圖左植物色素的減壓過濾，圖右植物殘渣上出現色素分離的現象

3.             以滴管吸取所有濾液，移至7毫升的樣品瓶中。

4.             於樣品瓶中加入3毫升的石油醚後劇烈搖晃。

圖7：加石油醚至2/3滿後充分搖晃即完成萃取

二、  未知物鑑定：如何確定分離出來的物質真的含葉綠素與花青素呢？

(一) 花青素鑑定：酸鹼反應

1.             拿出以水做溶劑的實驗樣品瓶，以滴管吸取樣品瓶下層的濾液，平均分裝置A, B, C三個樣品瓶中；於A樣品瓶中加入一小匙的固體檸檬酸，B樣品瓶加入一小匙的固體碳酸鈉。觀察並比較A, B, C三瓶溶液的顏色的差異。

2.             將A瓶溶液倒入B樣本瓶中，觀察樣本瓶內的變化。

圖8：不同酸鹼性下，水層萃取液的顏色的不同

(二) 葉綠素鑑定：螢光反應

1.             拿出以酒精做溶劑的實驗樣品瓶，以白光LED(可用手機閃光燈代替)或3in1驗鈔筆中的紫光或照射葉綠素層，可於90度處觀察到葉綠素吸收短波長輻射時所放出的紅色螢光。

 

圖9：以白光LED照射(左)以紫光LED照射(右)

2.             若有紫光雷射筆(波長：405 nm)，可從樣品瓶底部照射，觀察溶液變化。

圖10：以紫光雷射照射酒精萃取液，可看到花青素的白色螢光與葉綠素的紅色螢光

(眼睛不可直視雷射)

• 實驗技巧與建議

3.             萃取後下層可加入水(鹽水)增加極性，加強分離效果。

 

圖11：不同條件下萃取產物的顯色，左邊為水濾液，右邊三個則為酒精濾液

4.             光合色素易因照光而降解退色，應避光保存。

5.             濾液不可過濃，成品顏色才會鮮豔漂亮。

6.             若不過濾也可透過加入鹽水調整下層密度，使得不溶的雜質因比重介於鹽水與石油醚之間，即可使其自然聚集於兩層之間。

圖12：透過加水改變下層密度使得雜質聚集於水層與油層中間

7.             可透過劇烈搖晃樣品瓶，使兩層暫時混合，顯現出分離前的顏色(黃褐)，讓同學能直觀理解分離前之所以為黃褐色，是因為混合了綠色與紫色的色素。(傳統碘萃取無法達到此效果)

圖13：劇烈搖晃使上下層暫時混合可看出混合時呈現黃色

• 教學應用

本教案完整的教學流程包含以下五個階段：

(1)     連接先備知識：我們學過什麼好方法能解決現在的問題？

(2)     建立互溶表：如何找出物質之間潛在的規律並有效紀錄？

(3)     植物色素分離：實驗結果是否符合我們本來所預期的呢？

(4)     未知物鑑定：這些紫色的東西就一定是花青素嗎？

(5)     延伸活動：分離出來的葉綠素與花青素還能做什麼？

本文章為了突顯重點實驗而採取去脈絡化的方式呈現，實際上各個活動之間是承先啟後的關係，教師可視教學時數與教學需求而參考與調整。

一、  連接先備知識：我們學過什麼好方法能解決現在的問題？

(一)   從生活經驗切入主題：介紹鴨跖草與採集校園內紫色葉子的植物。

圖14：同學選用校園中的紫蘇葉來進行實驗

(二)  巨觀到微觀：觀察鴨跖草下表皮細胞中的葉綠素與花青素分布狀況。

圖15：學生以折撕法製作鴨跖草下表皮樣品與觀察的側拍照

(三)  驅動問題：請同學思考如何將葉綠素與花青素分離？

(四)  複習國中混合物分離：幫同學們達到相同的起點能力。

圖16：同學分享自己過去學過的混合物分離方法

(五)  文獻比對：根據國中所學查詢待分物的性質判斷適合的方法。

(108國小：溶解、磁性)(108國中：結晶、過濾、濾紙層析)

(六)萃取原理介紹：介紹高中新學的混合物分離方法並連接後續實驗。

(108高中：蒸餾、萃取、薄膜層析)

(七)  老師引導需學生將「如何將花青素葉綠素分離」拆解成「花青素和葉綠素與各分離技術有關的性質為何」這類可與文獻比較的問題。

(八)  教師提供「葉綠素和花青素與混合物分離方法相關的性質」，讓學生判斷過去所學的分離方式，何者較適合用來分離葉綠素與花青素。

下圖為學生歸納出的可能分離方式：

圖17：學生透過教師所提供的物質資料提出可能的分離方式

(九) 教師說明高中階段新學的分離方法−萃取，並指出萃取需要有兩不互溶的溶劑，作為後續活動的驅動問題。

※一般所稱的萃取常泛指利用溶劑於(1)固體中瀝取可溶性成分或於(2)不互溶溶劑之中，提取特定成分，此處萃取指的是後者。

二、   建立互溶表：如何找出物質間潛在的規律並有效紀錄？

(一)   驅動問題：那些溶劑可用於萃取(不互溶的兩溶劑)？

(二)   實驗藥品：水、乙醇、丙酮、石油醚(可選用正己烷或去漬油)、乙酸乙酯(示範用)

(三)   實驗器材：

1.             公用器材：250 mL燒杯*4、滴管*4

2.             小組器材：50 mL燒杯*4、滴管*4、7 mL樣品瓶*6

(四) 實驗介紹：

1.             目標：

■找出哪些溶劑彼此不互溶

■學習到同類互溶(親水性、極性)的概念

2.             方法：於公共區取用溶劑並於小組進行混合實驗

3.             示範：以水與乙酸乙酯示範混合溶液與何謂「不互溶」與如何紀錄結果

4.             提醒：

■同學需先想如何繪製表格紀錄實驗結果

■提醒同學若有觀察到互溶以外的表現(吸放熱)可記錄下來

5.             基於同類互溶並根據結果排出四溶劑對水的溶解度

(假設各溶劑對水溶解度有遞移律)

(五) 總結實驗結果：

 

圖18：不同溶劑混合後的現象(左)與混合結果歸納表格(右)

1.             根據互溶表結果可選用

(1)       水+石油醚

(2)       酒精+石油醚

2.             親水性：水>乙醇>丙酮>乙酸乙酯>石油醚

※ 溶解度與極性、碳鏈長度、氫鍵等因素有關

3.             深化學習：

　　本活動所觀察到之現象需用到高三範圍的極性、分子間作用力、理想溶液等概念加以解釋，教師可視學生狀況補充，或僅提及高三化學才會解釋，使學生對於未來學習保有期待。

三、                植物色素分離：實驗結果是否符合我們本來所預期的呢？

(一)    目標：透過實作將葉綠素與花青素分離

(二)   學習內容：

1.          操作瀝取、過濾、萃取與層析等混合物分離技術

2.          透過觀察巨觀的顏色變化去理解微觀下物質被分離

3.          根據同類互溶解釋不同溶劑所造成的效果

(三)   教師引導：為什麼用水作為溶劑時，葉綠素的含量很少呢？

四、                未知物鑑定：這些紫色的東西就一定是花青素嗎？

(一)    驅動問題：如何確定分離出來的物質真的含葉綠素與花青素呢？

                  利用葉綠素與花青素的物質特性。

(二)   物質特性：

	葉綠素	花青素
顏色	綠	紫
溶解傾向	脂溶性	水溶性
關鍵特性 (其他物質較少有)	吸收短波長光時會放出紅色螢光	可作為酸鹼指示劑

 

(三) 教師引導：從花青素的顏色連接學生學過的紫色高麗菜

五、 延伸活動：分離出來的葉綠素與花青素還能做什麼？

(一)     色層分析^[1]：脂溶性色素分離

1.             在分離出葉綠素與花青素之後，我們可以進一步的問同學分離出來的色素是否為純物質，進而帶到另一種能更精細的分離物質的方法－層析。

2.             除前面實驗步驟中所提到濾紙上的色素會自然分層外，教師也可用分離出的葉綠素或花青素進行色層分析，詳細作法可參考選修生物中的植物光合色素分離部分。

3.             可以使用前面建立互溶表時的廢液作為沖提液，或讓學生自行嘗試不同比例。

 

圖19：過濾用的濾紙花上的美麗色層(可觀察重疊處為黃色)(左)、脂溶性色素的層析圖(右)

(二)    酸鹼反應：天然指示劑
我們的課程從花青素的指示劑特性切入，學習了指示劑的原理並進行一系列與指示劑有關的實驗。下圖為可延伸的彩虹試管^[2]與酸鹼鑑定實驗(檢驗鹽酸、檸檬酸、氫氧化鈉與碳酸鈉，日後有機會再寫專文分享)實驗照片：

 

圖20：彩虹試管(左)、以iPad輔助進行酸鹼鑑定實驗(右)

(三)   校園植物色素採集：所學即所用

老師可以讓學生自由採集校園內的有色植物進行色素萃取，並比較其差異。一般校園內找的到且富含花青素的葉子有紫色地瓜葉、紫色酢醬草等植物。也可以比較看看紫色葉片與綠色葉片萃取後的顏色差異。

圖21：不同植物的萃取結果

(四) 光譜分析^[3]：進階物質鑑定法

可使用光源–樣品–分光器–攝影機架設簡易光譜量測系統，分析花青素的光譜吸收波長分布與實際顏色之間的關聯。

(此活動的先備課程包含了比爾定律、視光學、基礎光譜學、固態光譜量測)

圖22：學生架設簡易光譜量測系統測得兩種色素的吸收光譜

• 原理與概念

一、                葉綠素特性^[4,5]：

圖23：葉綠素的化學主結構(參考資料6)

吸收光能的葉綠素是地球上最多的生物色素，易溶於油脂內；植物行光合作用時固定二氧化碳的「核酮糖二磷酸縮化酶」(Rubisco)，是地球上最多的酵素；最多的天然有機化合物是植物的纖維素，它由光合作用所合成的葡萄糖聚合而成。葉綠素是不穩定的分子，植物每天都要合成新的，而類胡蘿蔔素則穩定多了。到了秋天，許多植物的葉片機能逐漸停止，無法補充喪失的葉綠素，因此綠色漸漸減少，類胡蘿蔔素的顏色就顯現出來了。

1883年，德國的植物學家安格曼(Theodor W. Engelmann)的實驗結果指出植物主要利用紅光與藍光進行光合作用。後來科學家陸續發現與光合作用相關的色素，在植物中最重要的是葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿蔔素，而這三者的吸收光譜，也呼應了上述實驗的結果。

圖24：光合色素的吸收光譜(參考資料5)

在化學的定義上，能夠吸收可見光的物質稱為色素。色素不會吸收可見光中的所有顏色的光，光合作用的色素亦然。當白光照射到色素時，沒有受到色素吸收的光，會反射或穿過色素，讓色素呈現出該波長的顏色。而色素分子會吸收哪些光，和分子所具有的電子軌域有關。

光合作用色素分子(也包括其他色素)有各種不同的電子軌域，每個軌域中具有的能量不同，像階梯一樣是不連續分佈的，高低的差異主要是由組成分子的原子以及分子的結構所決定。葉綠素呈現綠色主要是由於含有鎂，類胡蘿蔔素的顏色主要是由共軛雙鍵的數量所決定的。

圖25：–胡蘿蔔素的分子結構(具有長共軛系統)(參考資料7)

根據不相容原理與遞建原理，每個軌域中能容納的電子數量有限，而電子會先分佈於低階(能量較低)的軌域中，再依次往上填。在沒有受到光照的情況下，色素分子的電子處於能量最低的狀態，稱為基態(Ground state)。當適當波長的光照射到色素分子時，電子就會些接收光的能量，從基態軌域跳躍到能量比較高的軌域，此時的電子處於激發態(Excited state)。

在激發態軌域上的電子並不穩定，很快就會降回到基態軌域(10億分之一秒內)，這時電子當初吸收的能量便以熱能或振動的方式釋放出來，或者是放出光，這種光稱為螢光(Fluorescence)。如果用紫外線照射葉綠素，葉綠素會發出紅色的螢光。

二、                花青素特性^[7,8,9]：

圖26：花青素的化學主結構(參考資料8)

花青素(Anthocyanidin)泛指具有如上圖所示之主結構的物質，是一種水溶性的植物色素，存在於液泡內的細胞液中。花青素不穩定，自然界中花青素多以結合醣苷配基的方式存在，稱為花色苷。花青素與花的顏色、葉變紅等有關，是一種天然的抗氧化劑。

花青素不參與光合作用，但可吸收陽光以減緩光合色素受到過強的陽光照射而分解；此外，花青素的產生也會減緩葉綠素被氧化而變質的速率；同時，花青素也會抑制葉綠素所反射的綠光，使危害植物的昆蟲因不易偽裝，無法躲避天敵的掠食。花青素也能夠調解滲透作用，讓植物在不進行光合作用的情況下，卻能獲得較高濃度的滲透壓。同時花青素也具有保溫的作用，
讓植物在秋冬季節裡仍不畏懼寒冷，依然絢爛開放。

花青素除了能夠妝點植物以及保護植物外，對於人類也有相當大的幫助。花青素結構上的酚基易與過氧化物(自由基常見的前驅物)反應，藉由食用蔬果中或是透過提煉的花青素，可幫助清除體內過多的自由基與有害物質。

不發光的物質之顏色與該物質吸收的顏色有關，例如當白光照射吸收紅光與藍光的物質，則反射出來的光呈現該物質不吸收的綠色。而物質之吸光波長與其微觀的分子結構有直接的關係。圖27標示出花青素在不同pH值下所對應到的結構與顏色。從pH<3使得花青素扮演鹼的腳色與一個氫離子結合而帶正電(圖27中也表示出其共振結構)；在pH為6~7時則無帶電荷；而在pH為8~10時花青素扮演酸的腳色而釋放出一個氫離子而帶負電；在pH為8~10時則釋放出兩個氫離子而帶兩個負電；值得注意的是當pH>11時花青素發生了開環反應，最終分解成圖27左下角的結構，此為不可逆反應。

圖27：花青素結構於不同pH值時的結構與顯色(參考資料8)

三、                同類互溶：同類是什麼？

中學化學之中都會以同類互溶(Like dissolves like)來解釋物質的溶解度，而當同學想知道這邊所說的「同類」指的是物質的性質相似，教師一般會以極性觀點來解釋。然而，從文獻可知在建立互溶表時所使用的四種溶劑之偶極矩(列於上表)，其中可以觀察水與丙酮和水與乙酸乙酯這兩組溶劑，可以看出雖然水與丙酮的偶極矩差距(1.04)大於水與乙酸乙酯的偶極矩差距(0.07)，若單以極性來推論會得出水與乙酸乙酯較相似而可互溶的錯誤結論，顯然溶劑的互溶性並不能單純以極性觀點來解釋。實際上溶劑的溶解度主要受物質的極性、結構、碳鏈長度與作用力種類等多重因素影響，教師可視學生需求加以解釋。

四、                混合物分離：萃取與瀝取

一般所稱的萃取(Extraction)是指將存在於液相混和物系統中的特定化學物質分離到另一個較單純的液相系統中(L(A)⟶L'(A))的分離技術，其原理是透過特定化學物質與溶劑間溶解度差異，將它分離出來的化工單元操作程序(Unit operation process)。

順帶一提，大多數人會把萃取(Extraction)與瀝取(Leaching)搞混，所謂的瀝取是指存在於固相混和物系統中的特定化學物質分離到較單純的液相系統中(S(A)⟶L(A))，其原理是透過溶劑溶解固相混合物中的特定化學物質，就如同泡茶與泡咖啡的原理一樣，將此特定化學物質由固相分離出來。

五、                未知物鑑定^[10]：鑑定背後的理論基礎是什麼？

(一)   理則學：形式邏輯

1.             核心概念：若P則Q邏輯等價於 非Q則非P 不表示若Q則P。
。

2.             若葉綠素(P)則照射藍紫光會發出紅色螢光(Q)成立，表示若照射藍紫光不會發出紅色螢光者(非Q)則必定不是葉綠素(非P)，並不表示若照射藍紫光後發出紅色螢光者(Q)就一定是葉綠素(P)。

3.             換句話說，若未知物X只符合某已知物K中的少數特徵(Q成立)，並不能明確的斷定該未知物X是否為已知物K(P不一定成立)。但若未知物X不符合某已知物K的某一特徵(非Q)，則此未知物X必定不是該已知物K(非P)。

(二)     貝氏定理：條件機率

1.             核心概念：符合的條件越多，誤判的機率越低。

2.             未知物的特徵與已知物的特徵重疊度越高，則未知物的判斷的準確度越高。

3.             某物質外觀看起來是綠色(特徵1)且為水溶性(特徵2)，並在照射藍紫光時會產生紅色螢光(特徵3)，則此物質很可能為葉綠素。

• 結語

本教案從高中化學的第一單元－混合物分離出發，以鴨跖草為主體透過主題式的課程設計，讓同學進行一連串的科學活動，包含資料查詢、表格建立、實驗操作與結果分析，可為學生後續的科學研究鋪路。此外，本教案包含了化學與生物領域，並有許多的延伸活動可讓同學操作，同時具有廣度與深度。期望本實驗能引發學生對於化學的興趣，並從中學習到科學家處理問的工具與方式，未來不論在任何領域都能對其有所幫助。

因本文章內容涉及不同領域的專業，若有疏漏之處還請大家不吝指點。

• 誌謝

 

圖28：2019年亞洲化學教育年會海報論文獎獲獎合影

感謝廖旭茂老師本次的邀稿與審稿，讓我有機會與大家分享這個教案。鴨跖草色素分離實驗從第一次在2017於新竹女中做出來，到今日成為較完整的教案，一路上受到的幫助太多，在此特別謝謝幾位前輩的指導。

感謝張淳琤老師當時的邀請與王用慈老師的巧手將實驗做出來，謝謝周芳妃老師於2018年基礎科學年會餐敘時對教案所給予的建議，感謝我的好夥伴徐碩志老師與我一起開設選修課「製造彩虹的100種方法」讓這教案能被實踐，謝謝施建輝老師與高貫洲老師的勉勵與指導讓我成長茁壯，使該教案能於2019年拿到亞洲化學教育年會(NICE)海報論文獎並於2019高中基礎科學年會與老師們分享，感謝張佑祥研究員與林俞君組長協助本文校稿。

 

圖29：2019高中基礎科學年會分享照片

• 參考文獻

1.   建中生物。光合色素的色層分析：https://bre.is/eSBbxG8H

2.   楊水平。酸鹼彩虹玻璃管：https://scitechvista.nat.gov.tw/c/sH6U.htm

3.   科學Maker，Facebook社團：https://bre.is/8w5AEa9o

4.   葉綠素，維基百科：https://bre.is/Hv6fakpc

5.   龐中培。光合作用發現外星生命的新指標。科學人2008年、第075期05月號

6.   快樂小藥師。關於葉綠素及葉黃素還有類胡蘿蔔素：https://bre.is/NNQufPrA

7.   胡蘿蔔素，維基百科：https://bre.is/oDsFkU7D

8.   花青素，維基百科：https://bre.is/MwsnuxA5

9.   陳巧芸、李旺龍。植物的彩衣—花青素：https://reurl.cc/Y1WzyD

10. 柯文哲。Understanding Human Behaviors from the Perspective of Science：https://bre.is/KZu7scJE