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跨領域的台灣土肉桂探究之旅–抗菌設計篇
陳許玉鈴1*、廖旭茂1,2
1台中市立大甲高級中等學校、2教育部高中化學學科中心
■ 前言
本刊上期文章「跨領域的台灣土肉桂探究之旅–化學篇」(廖旭茂,2021)一文中提到選用台灣土肉桂作為自然科學探究與實作課程設計的對象,利用台灣土肉桂開發出「精油微型蒸餾」、「薄層層析TLC鑑定」等課程,做為跨科課程的教材研發夥伴,筆者認為,身為台灣特有種的台灣土肉桂,因其極易與外來種陰香混淆(張上鎮、林群雅,2014;陳正豐、尹華文、呂勝由,2008),且葉部含精油等特性,在生物課程中,不管是植物分類、型態、生理等領域,都有很多值得讓學生深究的價值,是一個適合開發課程的好材料。
■課程設計概念與教學目標
根據研究顯示台灣土肉桂葉部精油具有極佳的抑菌(周佳頤,2016)、抗螨、抗蚊…等生物活性,同時也具有抗氧化、降血糖、抗發炎、抗癌等人體生理功效(林鍵男,2011;吳淑靜,2005;張育維,2014)。針對肉桂或是台灣土肉桂精油抑菌能力進行探討的研究頗多,總括而言肉桂精油對不同的微生物抑制能力不同(何振隆、蘇裕昌,2008),且因台灣土肉桂不同品系中的精油成分差異(鄭森松、林群雅、王亞男、許原瑞、張上鎮,2008),故不同品系的抑菌能力也有所差別,以肉桂醛型台灣土肉桂的抑菌效果明顯較佳(張上鎮、林群雅,2014)。
為延續「跨領域的台灣土肉桂探究之旅–化學篇」(廖旭茂,2021)的課程設計,筆者選擇以「肉桂精油的抗菌功效」為主題,設計微生物培養實作課程,因先前課程中已向學生介紹肉桂精油的抗菌功效,故不應再以「驗證肉桂醛的抗菌能力」來作為學生實驗設計的主題,所以本教案設計的主要教學目標訂為讓學生學習「如何有效進行數據量化」,由學生自行設計量化分析方式,學習黴菌培養的方法,並希望學生能利用自己所設計的量化方式,進行實驗結果的數據分析,完成科學性實驗報告的撰寫。
■器材與藥品
每組所需的器材與藥品可能會因各組的設計不同而有所差異,但老師所需要的與需準備的必須包括以下各項:
1. 儀器:滅菌鍋、無菌操作台、電子天平、電磁加熱器(含攪拌子)。
2. 器材:微量吸管(含tip)、微量離心管、三角塗抹棒、滅菌袋、移植針(解剖針)、1000ml燒杯、油性簽字筆、塑膠培養皿、錫箔紙
3. 藥品:葡萄糖、胰化蛋白腖、瓊脂、70-75%酒精、蒸餾水(已滅菌)、肉桂醛(標準品)、青黴菌(固態培養)
■課程實施步驟
一、課前教師的準備工作
因是大班教學的分組實作,且整個黴菌培養實驗的所有步驟不可能讓學生在兩節課的時間內完成,所以為了讓整個課程能在有限的時間內如期完成,老師的課前準備項目非常重要。
必須由老師完成的項目有:
(一)黴菌菌種培養
雖然肉桂精油對多種微生物都有抑制效果,但考慮學生操作的方便性與安全性,筆者選用能讓學生帶離實驗室自行培養的黴菌。筆者建議至少於課前7-10天開始進行菌種培養。學生實作時建議老師提供的菌種是為1盤/組,若培養基中的黴菌數量夠多,則可沿用至下一班,若授課班級數眾多,則菌種培養盤數則需再增加。
圖1:黴菌菌種(青黴菌)培養
(二)學生實作用培養基
筆者選擇固態培養基而捨棄液態培養主要是考量有兩點,第一點學生不具有使用塗抹棒與無菌操作的先備知識與技巧,故為使實作過程能簡單易懂、好上手,實作時讓學生以塗抹棒塗抹精油,菌種則改採用接種針接種的方式,避免學生混淆、汙染器材。第二點接種菌後,學生需自行培養黴菌一星期,故為了讓學生培養、攜帶方便,使用固態培養會比液態培養適合。
為了簡化學生需要實作的步驟與減少學生因實作技巧不純熟而干擾實驗結果的風險,筆者採用由教師事先製備好培養基後再供各組使用的方式。在此課程中,學生每組能獲得2盤培養基,所以學生設計實驗時,必須考量培養基數量有限的條件。若學生塗抹精油時導致培養基破裂時,學生可向老師索取新的備用培養基重新施作。
配置培養基時,每1公升的蒸餾水中,添加葡萄糖等原料,約可製作65-75盤的固態培養基,相關培養基配方如下表1所示:
表1:培養基原料配方
培養基製備步驟:
1. 量取上述各種成分放入1000ml燒杯中。
2. 上述配方使用電磁加熱器攪拌溶解、煮沸後,以錫箔紙加蓋,經121 ℃、1.1atm 滅菌15分鐘,冷卻至約為50 ℃後。
3. 將滅完菌的培養基(約15ml/盤左右)倒入至無菌塑膠培養皿中,於室溫下靜置、凝固後冷藏備用。(倒培養基需在無菌操作台進行)
(三)器材滅菌與分組
本實驗所使用的微量吸管頭尖、固態培養基、接種針、塗抹棒等器材與蒸餾水都必須事先進行高溫高壓滅菌。理想情況是讓學生在無菌操作台中進行所有步驟,但因實驗室的操作台數量與空間都有限,故筆者採用的簡便方式是直接在一般實驗桌進行各項步驟。各組需要的溶液或材料實驗前均已分發到各組實驗桌上,實作前學生需先以75%酒精消毒實驗桌面與手,戴上口罩後,盡可能不再走動,且打開培養皿操作的步驟也要盡可能快速完成,期望能盡量減少雜菌汙染的機會,實驗完後實驗桌也要再酒精消毒一次。
圖2:抗菌實驗學生小組器材
(四)稀釋精油
本課程設計共有5種不同濃度的溶液(肉桂醛標準品原液、肉桂醛標準品原液等倍稀釋、肉桂醛標準品原液十倍稀釋、肉桂醛標準品原液百倍稀釋、已滅菌蒸餾水)供學生挑選,溶液的稀釋由老師進行的優點是老師可以使用無菌操作台進行無菌操作,控管精油的精準用量避免浪費,最重要的是節省學生實作的操作時間。
二、教學過程
本課程設計與「跨領域的台灣土肉桂探究之旅–化學篇」屬於同單元的不同探究主題,又因老師準備黴菌培養實驗材料需一週以上的時間,故本教案的設計採取與「跨領域的台灣土肉桂探究之旅–化學篇」穿插進行的方式。本課程每週兩節連排,共100分鐘/週,「跨領域的台灣土肉桂探究之旅」總教學時間需歷時5週,每次課程都是由兩位老師進行協同教學。
(一)第一週
本週化學科老師以在台灣屏東新埤國中發生過的故事為起頭,引發學生的學習動機,並介紹肉桂精油傳統的提煉的方法,及如何使用本校開發的微型蒸餾器,來提煉土肉桂精油;生物科老師的教學活動包括介紹台灣土肉桂與南洋肉桂的差異、並協助各組討論出實驗目的、說明本實驗的質性分析與量化分析等項目,特別是量化分析,必須由各組自行繪製量化設計圖並決定量化的方式。學生設計種菌的量化設計圖時,老師須提醒學生要留意(1)必須設置對照組且能清楚表現出實驗目的(2)要考慮得到結果(黴菌生長照片)後的量化方式(3)實驗重複次數。本實驗每組只有兩盤培養基,但學生必須在有限的材料中,做出「得到多次數據」的情形。以下是筆者學生們所設計的量化圖形A至E:
1. 圖A:此培養盤中可每個小圓為一觀察範圍,也可以圖中每一橫排為一組,共算成四個重複。在直徑1公分的小圓圓心處種菌,種完菌後每天觀察黴菌生長情形,因此圖所設定觀察的面積不大(直徑1公分的小圓),故量化方式可以選擇「計算單位時間內黴菌累計生長面積(%)」,也可以選擇「計算單位面積內黴菌生長所花時間(小時)」。雖然量化方式可有雙重選擇,但此設計的缺點是學生的操作時間會因種菌位置多(16處)而較長。
圖3:學生設計圖A
2. 圖B:將一組同心圓分成四個象限,在同心圓中十字焦點處每一象限種一次菌,整盤共有4處種菌位置。種完菌後每天觀察黴菌生長情形,記錄黴菌所達同心圓中的積分線位置,換算成得分,以此做為黴菌生長的量化數據。每一象限為一筆數據,分別記錄後再計算平均值,代表當天所記錄到的黴菌累生長速度。另外也可以以各積分線為觀察目標,記錄黴菌生長達特定積分線所花的時間(小時)。此設計圖的最大優點是種菌處位置集中易操作,但常見的人為失誤是所加入的精油過多或是加入精油後靜置時間不足,導致培養基表面仍有多餘精油未被培養基吸收,在此情形下種菌會使得黴菌菌絲或孢子隨著表面液體流到他處,而出現黴菌起始生長部位不如預期的情形。
圖4:學生設計圖B
3. 圖C:繪製四組同心圓,每組為一個觀察範圍,此培養盤共有四個重複。種菌位置為圖中紅色圓形處,整盤共有4處種菌位置。種完菌後的量化方式與上述2.相同,使用黴菌生長所達之積分線位置來進行量化,或是計算黴菌生長達特定積分線所花的時間。此設計圖操作時亦須留意塗抹精油後,培養基表面是否仍有過多的液體。
4. 圖D:整盤分成9大格,每3大格為一個觀察範圍,此培養盤共有三個重複。種菌位置為圖中紅色圓形處,整盤共有9處種菌位置。種完菌後的量化方式為計算3大格中黴菌累計生長面積(%),或是以特定小格面積為觀察目標,記錄黴菌生長達特定面積所花的時間(小時)。使用此設計圖的優點是對於不會或無法使用電腦繪圖的學生而言,可以直接使用現成的方格紙作圖。
5. 圖E:將整盤培養基分成四個象限,讓培養盤共有四個重複。圖中每一個象限中的記號處(小正方形)種菌。將每天拍得的黴菌生長照片利用影像分析軟體「ImageJ」影像相減功能,扣除種菌前影像,計算黴菌所生長的累計面積(%)。使用此方法的好處是學生完全不需要繪製任何量化設計圖,且電腦軟體分析會比肉眼觀測來的更為精準,但先決條件是學生必須懂得影像分析軟體「ImageJ」的使用方式。
圖7:學生設計圖E
(二)第二週
本週化學老師主要肉桂精油的微型蒸餾提煉、肉桂醛TLC結構鑑定;老師提供的學習單中包括學生必須進行資料搜尋,調查常見精油的來源與用途,並先至校園摘種土肉桂樹的地點打卡,記錄其GPS經緯度位置,實驗進行結束後,完成老師提供的學習單。
生物老師則利用各組實驗等待時間到各組與負責微生物培養實驗的同學進行討論,針對上週各組所設計的量化方式,討論、決定出下週各組黴菌培養的步驟。討論時,老師在學習單中勾選出需進行的步驟與順序,再由學生將需要進行的實作步驟統整後書寫於學習單(請參見附錄)。
(三)第三週
因時間緊湊,本週學生分為化學組與生物組;化學科老師主要進行肉桂醛的化學性質檢測,老師先進行有機化合物官能基的介紹,複習並建立先備知識後,再開始實驗。介紹完官能基後,生物組同學隨老師至生物實驗室進行相關時作課程;
因固態培養基體積小(15-20ml液態培養液凝固形成),不適合倒太多精油,一般吸管或10ml量筒的量取會不精準,故本課程需使用1000μl或200μl的微量吸管量取精油,所需支數最好能1支/組或1支/2組。進行微生物培養的各個步驟前,老師需先教導如何使用微量吸管,並讓學生實際練習,確定學生已能精準、正確的使用,才能開始實作。
圖8:學生操作微量吸管的過程
本週課程是學生真正的微生物學實作課程,老師需訓練學生學習使用微量吸管。之後再依以下步驟讓學生進行實作。
1. 以70-75%酒精消毒、清理無菌操作台面與雙手。
2. 各組挑選所需的肉桂醛溶液,使用油性簽字筆於培養盤蓋外層標註日期、班級、組別與處理方式。
3. 之後的步驟細節會因各組選擇不同的量化方式而有不同,但大致上順序是:
(1)打開培養盤上蓋,於培養基上加入精油。
圖9:圖左從離心管吸取精油,圖右將精油加入培養皿
(2)使用三角塗抹棒將精油均勻塗在培養基表層。塗抹面積由各組的設計圖決定。
圖10:三角塗抹棒精油塗抹過程
(3)蓋上上蓋,靜置5分鐘後,將培養盤放在設計圖上方,並做上記號。
圖11:按設計標示種菌的位置
(4)打開培養盤上蓋,使用解剖針沾取黴菌,在設計圖所指定的位置上種菌。
圖12:圖左為沾取黴菌菌種,圖右在指定位置種菌
(5)蓋上上蓋,靜置30分鐘後,以略濕的紙巾包裹培養盤,之後放入夾鏈袋中保存,由學生自行帶回培養觀察5天。拍照時間間隔由各組自行考量量化方式而決定。
(6)整理清潔環境,完成並繳回學習單。
採取讓學生自行帶回培養的方式是因為考量學校恆溫培養設備有限,但「學生自行培養」對整體實驗的確是一大風險,為避免此做法成為影響實驗成敗的關鍵,老師須提醒學生,同一組的培養基必須放置在同一環境中培養,必須在同樣環境條件下討論實驗組與對照組的差別才具有意義。但若是不同組別或班級的學生,所使用的環境條件確實是需討論的變因之一。
(四)第四週
本週課程由生物老師主導。學生需將所帶回的培養盤與所拍的所有觀察照片帶至課堂,小組進行實驗結果的分析與討論。依不同設計圖種菌,黴菌生長分布情形當然會有所不同,所以老師主要的教學活動是使用學習單引導學生討論,並加入各組,實際確認各組成果,協助學生完成數據的量化分析與實驗結果的呈現。
圖13:學生黴菌培養結果。左圖與右圖都有發生黴菌未按預期種菌部位生長的情形。
由課堂各組學生實驗結果的回饋可知,肉桂醛的抗菌能力極好,以圖13中最右圖的觀察資料為例,使用「肉桂醛標準品原液」與「肉桂醛標準品原液百倍稀釋」進行培養,兩盤黴菌生長情形有顯著的差異(P<0.001)。
圖14:學生黴菌培養數據分析結果。
進行微生物學實驗時最怕學生養不出黴菌進而無法完成後續的討論,但筆者認為,只要教學前老師各項準備工作都已確實完成,則不管學生的成果為何,都有值得探討之處。以下舉幾項課程進行可能面臨到的問題與建議的調整方式,以供參考:
1. 黴菌生長的起始位置不在預設設計圖中種菌位置。此情形通常是因為加入的精油過多或是加入精油後靜置時間不足而導致培養基表面仍有多餘精油未被培養基吸收,才使得黴菌菌絲或孢子隨著表面液體流到他處。老師可建議學生數據分析時,將設計圖的種菌記號對準黴菌生長起始位置,校正後再做數據分析。
圖15:調整種菌與黴菌實際生長的位置
2. 黴菌生長分布的面積狀況已無法使用原先的設計圖進行數據分析。小組討論時,老師可引導學生探討「如何更改量化分析方法」例如使用「ImageJ」影像分析軟體,跳脫原先的設計圖,改以其他更合理、精準的方式量化實際觀察到的狀況。
3. 出現有創意但量化不夠精準的設計圖。筆者認為只要小組討論出來的設計圖能兼具「設置實驗組與對照組、能重複實驗、符合實驗目的」等原則,授課老師就應允許學生以所設計的圖進行實作,之後再就所得的實作成果讓各組自行評估、檢討自己的設計有何優缺點。
4. 學生兩盤培養盤都沒有任何黴菌生長。小組討論時,老師可引導學生往以下四個方向探討,依序為(1)黴菌生長的條件、(2)實驗操作時的注意事項、(3)實驗操作時的人為疏失、(4)實驗目的(設計)的調整。雖然實驗無法讓學生重作,但可以讓學生以書面的方式說明「改善實驗結果的方法」。
5. 實驗過程受其他雜菌汙染,以至於實驗結果出現其他菌種生長的菌落。因為本實驗實作過程與學生自行培養、觀察過程皆不是無菌操作,發生其他雜菌生長的機率很高,筆者的作法是第三週實作課時,提醒學生確實做好消毒工作,並且操作時盡可能快速完成。學生帶回自行培養時,提醒學生每次拍照不開培養皿上蓋,以避免汙染。若真有發生汙染情形,則計算黴菌生長數據時,只計算青黴菌(老師提供的菌種)生長的部分,但學生在書面報告中可以針對汙染部分加以討論,以「雜菌生長對本實驗結果的影響」為論點,提出他們的看法。
(五)第五週
本週的授課內容主要是讓學生進行小組報告與繳交書面報告,但為了讓學生能更專心聽各組的成果分享,也為了要讓學生能自己判斷、反省何謂「有效的量化方式」,筆者設計了兩項「票選活動」,第一項是量化最佳創意設計票選(每位投票人可投兩組),獲最高票的兩組勝選,第二項是精準量化票選(每位投票人可投1組),由老師根據該班各組的實驗結果,選出所設計的量化方式較為精確的組別,兩項票選獲獎的組別與支持它的投票者都能獲得加分的獎勵。
■結語
「跨領域的台灣土肉桂探究之旅」是結合化學科與生物科的跨科合作且進行協同教學的課程設計,利用台灣特有的台灣土肉桂為素材,設計出一系列的探究、實作課程。精油微型蒸餾、薄層層析TLC鑑定、微生物培養等看似各自獨立的課程,藉由對台灣土肉桂的探究而被緊密的連貫在同一個主題之中,顯見「台灣土肉桂」確實是個開發課程的好材料,再者,不同於其他肉桂植物的產油、儲油部位,肉桂精油的眾多功效,甚至是將肉桂精油應用於食品、醫藥、美容藥妝、環境衛生用品等領域(楊政川、李世傑、何坤益、林敏宜,2010),若針對這些面向進行探究,筆者相信「台灣土肉桂」一定能為高中自然教育作出更多的貢獻。
■參考文獻
1. 何振隆、蘇裕昌(2008)。精油之抗菌活性。林業研究專訊,15(3),31-37。
2. 吳淑靜(2005)。祕魯酸漿抽出物及肉桂醛抗肝癌機制之研究。未出版之博士論文。高雄:高雄醫學大學天然藥物研究所。
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5. 陳正豐。尹華文。呂勝由(2008)。正視陰香對土肉桂的衝擊。台灣林業,12,26-30。
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7. 張上鎮。林群雅(2014)。土肉桂簡易鑑別法及葉片驚奇功效。台灣林業,40(1),63-68。
8. 楊政川。李世傑。何坤益。林敏宜(2010)。台灣森林特產物-土肉桂。科學發展,446,28-33。
9. 鄭森松、林群雅、王亞男、許原瑞、張上鎮(2008)。臺灣土肉桂種源庫之設置-葉子精油成分與化學多態性分析。臺大實驗林研究報告,22(1),21-34。
10. 廖旭茂、陳許玉鈴(2021)。跨領域的台灣土肉桂探究之旅–化學篇。臺灣化學教育,41,取自http://chemed.chemistry.org.tw/?p=40042。
■附錄—「天然植物精油–微生物培養 小組討論單」
此份討論單需使用4週的授課時間,每次上課完成不同的段落,待第4週各段書寫完畢時,老師將以此份討論單內容為依據,向學生說明如何書寫書面報告。以下是討論單內容:
天然植物精油—微生物培養 小組討論單
班級 組別
一、工作分配表
二、實驗設計:以下各細項的書寫內容請參考上課講義
(一)主題:肉桂醛對黴菌生長的影響(讓學生自行填寫)
(二)實驗目的:(讓學生參考下方三選項自行討論後擇一填寫)
1. 探討不同濃度的肉桂醛精油對黴菌生長的影響
2. 探討不同濃度的肉桂醛精油抑制黴菌生長的效果
3. 找出最有效卻也是最經濟的肉桂醛精油抑菌方法
Ø 補充說明:請選擇至少兩種不同濃度的液體進行黴菌生長測試
所選擇的液體 請說明如此選擇的目的(理由)為何
實驗組:
對照組:
(三)實驗設備與材料:(各組依實際實作的情形列舉)
(讓學生自行填寫)
(四)量化設計:請小組討論後,寫下你們組想要「如何進行量化」,並畫下你們想要的畫菌(種菌)的設計圖
1.請選擇你們想要的量化方式:(請勾選)
□計算黴菌的累計生長面積(固定時間算面積)
□比較黴菌的生長時間快慢(固定面積算時間)
□其他
2.請畫出設計圖:每組會有兩盤固態培養基(在下次實作課前,請將以下草稿電繪並列印出來)
請描述、說明設計圖的細節:
(五)實驗步驟:請參考上課講義
1. 以70-75%酒精消毒、清理無菌操作台面與雙手
2. 將肉桂醛標準品以無菌水進行不同倍率的稀釋備用(由老師統一提供,讓各組直接選用)
3. 使用油性簽字筆於培養盤蓋外層標註日期與組別
Ø 之後的步驟會因不同的量化方式而有不同,以下步驟的細節需由各組的設計圖決定施作的方式,下表各步驟的描述供各組參考,各組須在實作前討論出你們自己的操作步驟
(讓學生自行填寫)
4. 靜置 (請填入時間),待培養基表面液體乾後才能移動或將培養皿翻面培養,若液體一直未乾,則第一日先正立培養,第二日起再翻面培養
5. 將處理好的培養皿移置培養盒中,再次以70-75%酒精消毒、清理無菌操作台面。
6. 之後,每 小時拍照觀察一次,計算 (填範圍)內黴菌生長的情形。拍照時,將培養皿置於設計圖上,對準記號後,開上蓋,以最快的速度拍照存證,完後蓋上上蓋,繼續培養。
7. 記錄 ,以此做為量化的指標
(六)實驗結果記錄
1.黴菌實際生長情形(每天拍照記錄):拍照後請妥善保存照片檔,以供書面報告與上台報告之用(讓學生自行填寫)
生長天數 | 第0天(實驗當天) | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 |
拍攝日期 | ||||||
拍攝人員 |
2.結果彙整:請各組根據所選擇的量化方法,自行選用適合的表格(擇一即可)
(1)黴菌的累計生長面積:請先定義「黴菌的生長範圍」與「如何計算生長面積比例」
Ø 所要進行觀察黴菌的生長範圍:(讓學生自行填寫)
Ø 如何計算生長面積比例:(讓學生自行填寫)
Ø 表格內容供各組參考,實際進行結果量化分析時,各組需自行繪製更適合的表格
(2)累計生長面積下黴菌所需的生長時間:請先定義「黴菌的生長範圍」與「如何計算生長面積比例」
Ø 所要進行觀察黴菌的生長範圍:(讓學生自行填寫)
Ø 如何計算生長面積比例:(讓學生自行填寫)
Ø 表格內容供各組參考,實際進行結果量化分析時,各組需自行繪製更適合的表格
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(3)不選擇以上兩種表的任一種者,請自行設計記錄用表格,並繪製於下方空白處
(讓學生自行填寫)
(七)實驗結果分析與討論(以下各項讓學生自行填寫)
1.本組將選擇 圖 (ex圓餅圖、長條圖、折線圖……)來呈現我們的實驗結果
繪圖區
2.根據每日所觀察到的黴菌生長照片與分析結果,我們認為(請為你們的實驗結果下一個結論,下結論前請注意你們當初的實驗目的!!)
3.本組的實驗結果是否有符合實驗前的預測(或實驗目的)?
□有符合,理由是
□不太符合,導致結果不符合預測的可能原因是
4.評估我們設計的「量化」方法之優缺點
說明 | |
優點 | |
缺點 |
5.其他討論事項: