跨領域的台灣土肉桂探究之旅–抗菌設計篇 陳許玉鈴1*、廖旭茂1,2 1台中市立大甲高級中等學校、2教育部高中化學學科中心 *neuron-d@yahoo.com.tw ■ 前言     本刊上期文章「跨領域的台灣土肉桂探究之旅–化學篇」（廖旭茂，2021）一文中提到選用台灣土肉桂作為自然科學探究與實作課程設計的對象，利用台灣土肉桂開發出「精油微型蒸餾」、「薄層層析TLC鑑定」等課程，做為跨科課程的教材研發夥伴，筆者認為，身為台灣特有種的台灣土肉桂，因其極易與外來種陰香混淆（張上鎮、林群雅，2014；陳正豐、尹華文、呂勝由，2008），且葉部含精油等特性，在生物課程中，不管是植物分類、型態、生理等領域，都有很多值得讓學生深究的價值，是一個適合開發課程的好材料。 ■課程設計概念與教學目標     根據研究顯示台灣土肉桂葉部精油具有極佳的抑菌（周佳頤，2016）、抗螨、抗蚊…等生物活性，同時也具有抗氧化、降血糖、抗發炎、抗癌等人體生理功效（林鍵男，2011；吳淑靜，2005；張育維，2014）。針對肉桂或是台灣土肉桂精油抑菌能力進行探討的研究頗多，總括而言肉桂精油對不同的微生物抑制能力不同（何振隆、蘇裕昌，2008），且因台灣土肉桂不同品系中的精油成分差異（鄭森松、林群雅、王亞男、許原瑞、張上鎮，2008），故不同品系的抑菌能力也有所差別，以肉桂醛型台灣土肉桂的抑菌效果明顯較佳（張上鎮、林群雅，2014）。     為延續「跨領域的台灣土肉桂探究之旅–化學篇」（廖旭茂，2021）的課程設計，筆者選擇以「肉桂精油的抗菌功效」為主題，設計微生物培養實作課程，因先前課程中已向學生介紹肉桂精油的抗菌功效，故不應再以「驗證肉桂醛的抗菌能力」來作為學生實驗設計的主題，所以本教案設計的主要教學目標訂為讓學生學習「如何有效進行數據量化」，由學生自行設計量化分析方式，學習黴菌培養的方法，並希望學生能利用自己所設計的量化方式，進行實驗結果的數據分析，完成科學性實驗報告的撰寫。 ■器材與藥品    每組所需的器材與藥品可能會因各組的設計不同而有所差異，但老師所需要的與需準備的必須包括以下各項： 1.  儀器：滅菌鍋、無菌操作台、電子天平、電磁加熱器（含攪拌子）。 2.  器材：微量吸管（含tip）、微量離心管、三角塗抹棒、滅菌袋、移植針（解剖針）、1000ml燒杯、油性簽字筆、塑膠培養皿、錫箔紙 3.  藥品：葡萄糖、胰化蛋白腖、瓊脂、70-75%酒精、蒸餾水（已滅菌）、肉桂醛（標準品）、青黴菌（固態培養） ■課程實施步驟 一、課前教師的準備工作     因是大班教學的分組實作，且整個黴菌培養實驗的所有步驟不可能讓學生在兩節課的時間內完成，所以為了讓整個課程能在有限的時間內如期完成，老師的課前準備項目非常重要。 必須由老師完成的項目有：   （一）黴菌菌種培養     雖然肉桂精油對多種微生物都有抑制效果，但考慮學生操作的方便性與安全性，筆者選用能讓學生帶離實驗室自行培養的黴菌。筆者建議至少於課前7-10天開始進行菌種培養。學生實作時建議老師提供的菌種是為1盤/組，若培養基中的黴菌數量夠多，則可沿用至下一班，若授課班級數眾多，則菌種培養盤數則需再增加。 圖1：黴菌菌種（青黴菌）培養   （二）學生實作用培養基     筆者選擇固態培養基而捨棄液態培養主要是考量有兩點，第一點學生不具有使用塗抹棒與無菌操作的先備知識與技巧，故為使實作過程能簡單易懂、好上手，實作時讓學生以塗抹棒塗抹精油，菌種則改採用接種針接種的方式，避免學生混淆、汙染器材。第二點接種菌後，學生需自行培養黴菌一星期，故為了讓學生培養、攜帶方便，使用固態培養會比液態培養適合。     為了簡化學生需要實作的步驟與減少學生因實作技巧不純熟而干擾實驗結果的風險，筆者採用由教師事先製備好培養基後再供各組使用的方式。在此課程中，學生每組能獲得2盤培養基，所以學生設計實驗時，必須考量培養基數量有限的條件。若學生塗抹精油時導致培養基破裂時，學生可向老師索取新的備用培養基重新施作。     配置培養基時，每1公升的蒸餾水中，添加葡萄糖等原料，約可製作65-75盤的固態培養基，相關培養基配方如下表1所示：                 表1：培養基原料配方 培養基製備步驟： 1. 量取上述各種成分放入1000ml燒杯中。 2. 上述配方使用電磁加熱器攪拌溶解、煮沸後，以錫箔紙加蓋，經121 ℃、1.1atm 滅菌15分鐘，冷卻至約為50 ℃後。 3. 將滅完菌的培養基（約15ml/盤左右）倒入至無菌塑膠培養皿中，於室溫下靜置、凝固後冷藏備用。（倒培養基需在無菌操作台進行）  （三）器材滅菌與分組     本實驗所使用的微量吸管頭尖、固態培養基、接種針、塗抹棒等器材與蒸餾水都必須事先進行高溫高壓滅菌。理想情況是讓學生在無菌操作台中進行所有步驟，但因實驗室的操作台數量與空間都有限，故筆者採用的簡便方式是直接在一般實驗桌進行各項步驟。各組需要的溶液或材料實驗前均已分發到各組實驗桌上，實作前學生需先以75%酒精消毒實驗桌面與手，戴上口罩後，盡可能不再走動，且打開培養皿操作的步驟也要盡可能快速完成，期望能盡量減少雜菌汙染的機會，實驗完後實驗桌也要再酒精消毒一次。 圖2：抗菌實驗學生小組器材 […]

跨領域的台灣土肉桂探究之旅–化學篇 廖旭茂1, 2,*、陳許玉鈴1 1台中市立大甲高級中等學校 2教育部高中化學學科中心 *nacl880626@hotmail.com n  簡介 數千年前，中國神農氏，嘗百草，解救了千千萬萬黎民眾生，形形色色的植物的根、莖葉、果實，成了華人醫療保健、養生飲食的首選，更進一步發展成獨具特色的中醫。本實驗模組研究肉桂、豆蔻、香草、檸檬、柑橘等具有特殊香氣的芳香植物，與其體內所含的精油理化性質的探究與鑑定1。 肉桂是古老的香料植物，也是長久以來最常用的中藥材之一；特殊的香氣，是五香之一，常用於燉肉提味上；近年來，肉桂皮研磨的粉末多用於風味麵包、甜點與調味咖啡的製作；肉桂在醫藥上可以增強消化功能，幫助排除消化道的積氣，甚至可以降低血糖的功用1。肉桂的氣味與功效主要來自製肉桂精油中的肉桂醛（含有90 %以上），學名為2-丙烯醛，結構中含有烯基與醛基，這兩個官能基在化學上可進行加成、氧化還原反應。本實驗利用自製的電熱式微型蒸餾器2，透過加熱酒精蒸氣，分離出土肉桂葉中的肉桂精油等成分；隨著運用薄層層析TLC鑑定經由中肉桂醛的存在，並檢測其分子不飽和的結構與反應性。肉桂醛因具令人愉悅的天然香氣，並具有殺菌功能，常用於口香糖，冰淇淋，糖果，飲料中。下圖為常見的肉桂。 圖1：由左而右依序為肉桂皮、肉桂粉與土肉桂葉 本單元是學校高二生物化學跨科探究與實作的課程的一部份，會選土肉桂做為題材，起因於2010年前後，筆者參加的一場演講說起，當時中央大學的洪蘭教授在會中分享了一個有關屏東縣新埤國中將肉桂葉變黃金的故事3，這麼一個有溫度、在地的故事深深吸引筆者，跟自然科討論後，列入探究與實作的主題。台灣土肉桂屬於樟科的常綠喬木，跟中國、東南亞的肉桂不同，其肉桂精油分布在土肉桂葉片而不是樹皮，取精油時，不用剝除其樹皮，傷其樹幹，因此適合作為探究的主題。本課程另一部分生物篇將探討抗菌設計的部分課程，有機會待下回再分享。 n  原理與概念 本實驗的設計分為精油的提煉、性質檢測，以及TLC鑑定三個部分，其原理和概念分述如下： 大部分的植物精油是疏水性的，密度也多比水輕，以水蒸氣蒸餾法來提煉法居多，為避免高溫影響精油的結構，也有一些使用溶劑萃取，或CO2超臨界流的方式萃取4；肉桂醛，微溶於水，密度為1.05g/mL，略重於水，可與酒精完全互溶，沸點為248℃。為避免高溫蒸餾，影響結構，先以酒精萃取肉桂葉粉末，並以超音波震盪，破壞細胞壁，促使精油提煉效率提高。下圖為肉桂醛的結構式。 圖2：肉桂醛的結構式 肉桂醛的結構中，有烯基、醛基，若欲檢測烯基，可使用溴水溶液，溴可與烯2-丙烯醛的烯基產生加成性反應，轉為2, 3- 二溴苯丙醛；若欲檢測醛基的存在，實驗室中最方便的可先以KMnO4(aq)溶液的酸性溶液反應，轉變成丙烯酸，而使紫紅色褪色；不過使用高錳酸鉀液來檢驗肉桂醛情況可能有些複雜，高錳酸鉀在酸性環境可與醛基反應，產生無色的亞錳離子與肉桂酸，但也有可能與酒精作用，只是反應速率較慢，此外高酸酸鉀亦有可能與烯基作用，生成二醇類與二氧化錳沉澱。下圖左、右發現第一排最左邊的對照組靜置5分鐘後，發生紫紅色褪色，且有黃褐色沉澱物，判斷為二氧化錳。 圖3：圖左為剛加入試液的顏色，圖右為5分鐘後的顏色，對照組的紫紅色發生褪色 有鑑於此，多侖試液可以用來檢驗醛基，產生銀鏡反應，似乎是比較適合的檢測試劑，下圖為肉桂醛與多侖試液作用。 圖4：左邊孔穴為對照組，右邊是肉桂醛標準液發生銀鏡反應     TLC的鑑定，展開液的選擇是一個大問題，考量點有二，一是從溶劑的極性考量，根據文獻5溶劑的相對極性的大小：醋酸（1.049）>水（0.998）>甲醇（0.762）>乙醇（0.654）>乙酸（0.648）>丙酮（0.355）>氯仿（0.259）>乙酸乙酯（0.228）>乙醚（0.117）>苯（0.111）>四氯化碳（0.052）>正己烷（0.009）。二是方便性，容易取得，三是安全考量，毒性越低的適當。因此選了正己烷與乙酸乙酯。 展開結束後，以殺菌用254nm的紫外光照射事先塗布螢光劑的TLC片，標準肉桂醛溶液會出現紫黑色信號，如果蒸餾液也在相同位置出現信號，則可確認蒸餾液中含有肉桂醛。下圖為紫外光下的肉桂醛信號。 圖5：UVC光下TLC片出現的肉桂醛吸收光的情況 n  器材與藥品 1.      藥品：乾的肉桂葉0.5克、試藥級肉桂醛（>98 %）、乙醇5毫升、0.01 M高錳酸鉀（KMnO4）溶液 (盛裝於10毫升樣本瓶中）、1.0 M硫酸（H2SO4）溶液（盛裝於10毫升樣本瓶中）、0.5M硝酸銀（AgNO3）溶液(盛裝於10毫升樣本瓶中）、乙酸乙酯2毫升、正己烷6毫升。 2.      器材：微型電熱式蒸餾模組、陶瓷孔盤（3ⅹ4）1個、TLC薄層層析片（3 cm × 7 cm）/組、120毫升樣本瓶/組、毛細管（10 cm）2支/組、塑膠滴管（3毫升）3支、強力磁鐵（Φ=5mmⅹ2mm）、L型鍍鋅角鐵。 n  建議實施實施步驟 l 建議實驗活動步驟-1：利用微型蒸餾萃取土肉桂中的精油 1.      事先摘取土肉桂葉，曬乾後（亦可用烘箱60℃低溫烘乾），撕裂成碎片後，以研磨機(或磨豆咖啡機器)打成粉末，備用。下圖為研磨成品。 圖6：研磨成品的肉桂粉及肉桂葉 2.      取自製的電熱式蒸餾瓶2，打開瓶蓋，以刮勺取約0.5公克的肉桂葉粉末，加入瓶中，再加入10毫升的酒精，隨後以玻棒適當攪拌均勻，蓋在瓶蓋，隨後以超音波震盪約5~10分鐘，水溫設定50℃。下圖為震盪過程。 圖7：多組肉桂液試液一起震盪的過程 3.      震盪結束，將微型電熱式蒸餾器組裝好，冷凝管循環水杯中放入少許冰塊與自來水，以冷卻凝結蒸餾出蒸氣。再取一直流電源供應器，將紅、黑鱷魚夾線導線分別連接微型蒸餾器的兩個卡扣（作法如筆者前一篇文章所述，請參見台灣化學教育期刊1），下圖為微型蒸餾與收集瓶的裝置圖。 […]