微量化學實驗:常見食物酵素的微量檢驗 / 蘇韋嘉、李佳蕙、楊水平

星期一 , 11, 七月 2016 Leave a comment

微量化學實驗:常見食物酵素的微量檢驗

蘇韋嘉、李佳蕙、楊水平*

國立彰化師範大學化學系
*yangsp@cc.ncue.edu.tw

n  前言

與「食物酵素(又稱酶,enzyme)」有關的高中課程,在102課程綱要的高級中學選修化學提到「生物體中的大分子」的應修內容,和「醯胺基、肽鍵與蛋白質、酵素」的說明;高級中學基礎化學(三)提到「影響反應速率的因素」的應修內容,和「催化反應與催化劑」的說明;並且在高中基礎化學實驗中提到「碘酸鉀與亞硫酸氫鈉的反應速率」的說明。在107新課程綱要(草案)的化學選修中提到「CJe-a-4催化劑與酵素的性質及其應用」的學習內容,和「以常見實例說明催化劑與酵素的性質與應用」的說明。無論新舊課程綱要,有關酵素的化學學習內容只有知識面的學習,而沒有催化劑與酵素方面的動手做實驗。

本實驗設計旨在讓學生連結化學到生活中,以動手操作化學實驗體驗生物化學中酵素的奧妙,透過微量實驗的設計,減少廢棄物的產生,建立綠色化學與永續發展的概念。藉由親自操作實驗讓學生了解到生活常見的酵素。現行國外傳統檢驗食物中酵素的方法,大多以大量或少量的方式進行,而非以微量方式展現,藥品使用量大,實驗過程時間長,並且在化學實驗室中進行。因此,我們企圖改善這些缺點,以貼近生活為導向,設計適合於教堂中教學的微量化學實驗。

n  原理和概念

一、  澱粉酶(Amylase

澱粉分為直鏈澱粉amylose)和支鏈澱粉(amylopectin);直鏈澱粉遇到碘分子或三碘離子生成藍紫色的錯合物,如圖一左所示。而支鏈澱粉遇碘試劑(Iodine reagent呈紫紅色的錯合物。澱粉酶能使澱粉分解成葡萄糖,如圖一右所示。葡萄糖無法使碘液變成藍紫色或紫紅色,而呈現碘液原本的棕色,此與對照組的藍紫色不同,因此呈現棕色視為含有澱粉酶的陽性反應。

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圖一:澱粉與三碘錯離子形成錯合物(左);澱粉酶使澱粉分解成葡萄糖的示意圖(右)

(圖片來源:http://goo.gl/0YHlQ7https://pmgbiology.com/tag/amylase/

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圖二:呈現藍紫色視為陰性反應(左);呈現碘液原本的棕色視為陽性反應(右)

二、  蛋白酶(Proteases

在鹼性溶液中,蛋白質或肽鍵與雙縮脲試劑(Biuret reagent)中的Cu2+反應而形成紫紅色的複合物,如圖三左所示;呈現的顏色深淺與蛋白質濃度成正比。蛋白質分子較小,呈現淡紫紅色,而分子量較大的則呈現紫色或藍紫色。蛋白酶是生物體內的一種酵素,能分解蛋白質,打斷蛋白質的胜肽鍵成為胺基酸,如圖三右所示。蛋白酶具有嚴格的選擇性,一種蛋白酶只能水解在蛋白質中一定的胜肽鍵上。當蛋白酶分解蛋白質而生成胺基酸,就無法與雙縮脲試劑反應,呈現試劑原本的藍色或紫色變淡,視為含有蛋白酶的陽性反應,如圖四所示

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圖三:蛋白質或肽鍵與Cu2+反應而形成複合物(左);蛋白酶水解蛋白質而生成胺基酸(右)

(圖片來源:https://goo.gl/ShV7A6https://pmgbiology.com/tag/protease/

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圖四:右邊呈現藍色視為含有蛋白酶的陽性反應

三、  脂肪酶(Lipases

油脂(Oils and Fats)是油與脂肪的合稱,又稱為三酸甘油酯,由脂肪酸和甘油的脫水反應產生而成。脂肪酶能催化脂類的酯鍵的水解反應,使三酸甘油酯分解成甘油單脂和脂肪酸,如圖五左所示。水解反應產生的脂肪酸具有酸性,導致被檢驗的溶液之pH值下降,而使酚紅(phenol red)指示劑呈現黃色。酚紅在pH 8.2以上呈現紅色,在酸在pH 6.8以下呈現黃色,此檢驗的實驗組呈現黃色,視為陽性反應,如圖五右所示,這與對照組的紅色不同。

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圖五:三酸甘油酯(Triglyceride)分解成甘油單脂(monoglyceride)和脂肪酸(fatty acids)(左);呈現黃色視為含有脂肪酶的陽性反應(右)

(圖片來源:http://goo.gl/fBhY4cl(左))

四、  過氧化氫分解酶(Catalase

過氧化氫分解酶催化過氧化氫分解成氧氣和水的酵素,有冒泡的現象(氧氣產生)視為陽性反應,如圖六所示

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圖六:右邊有冒泡的現象視為陽性反應

n  藥品、器材及配製試劑

一、  藥品和器材(全班用量)

吹風機 1兩組、棉花棒 1盒、眼藥水瓶(10-15 mL 7組、塑膠杯 4個、澱粉 少許、蛋白 少許、植物油 少許;配製試劑的藥品及其用量如下所示。

二、  配製試劑(全班用量)

1.        用於澱粉酶(amylase)檢驗,(1)配製0.5%澱粉液:0.5 g的澱粉溶於50 mL的水中,煮成透明狀。(2)碘試劑:直接使用市售優碘(含1%有效碘)。這兩種溶液分裝在6-10個眼藥水瓶中。

2.        用於蛋白酶(proteases)檢驗,(1)配製2.5%蛋白液:溶於1 mL的雞蛋蛋白在40 mL的蒸餾水。(2)配製雙縮脲試劑(Biuret reagent):取10 gNaOH,溶於100 mL的蒸餾水中;取1.4 gCuCl2·2H2O溶於100 mL的蒸餾水中。使用時再混合需要的量,此試劑分裝在6-10個眼藥水瓶中。(3)配製0.025 M NaOH:溶解0.10 g的氫氧化鈉在100 mL的蒸餾水中。這三種溶液分裝在6-10個眼藥水瓶中。

3.        用於脂肪酶(lipase)檢驗,(1)配製酚紅指示劑:取0.04 g的酚紅(phenol red)溶解在5.7 mL0.02 N NaOH,稀釋到100 mL的蒸餾水中。此溶液分裝在6-10個眼藥水瓶中。

4.        用於過氧化氫分解酶(catalase)檢驗,直接使用市售的3% H2O2即可。此溶液分裝在6-10個眼藥水瓶中。

n  檢驗表和待測食物

一、   檢驗表

由作者設計的常見食物酵素(澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶、過氧化氫分解酶)微量檢驗表,如圖七所示。學生在檢驗前,先填寫待檢驗的食物名稱在表格的左邊空格上,然後放入透明塑膠資料夾內,即可進行食物檢驗。

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圖七:各種酵素的檢驗表

二、   待測食物的準備和前處理

1.        準備天然食物或加工食品的待測物,可依教師教學需要或學生常吃的食物來準備,這些待測物可由師生共同準備。

2.        優先準備一些富含特定酵素的食物或加工食品,例如:香蕉木瓜番茄蘋果及藥局販賣的綜合酵素等。

3.        在檢驗前,有些食物或加工食品適合榨成蔬果汁,有些適合切成細小塊,有些適合壓成碎小塊,需要量不多,以方便放在檢驗表的表格內即可。

n  檢驗步驟

一、  澱粉酶(Amylase

1.        分別在對照組和實驗組的表格內滴加一滴0.5%澱粉液。

2.        以壓汁等方式使待測物成液體狀,或直接使用液體的待測物,在實驗組的表格內滴加一滴待測物,對照組則不加;然後用牙籤均勻攪拌混合液

3.        等待5分鐘後,分別在對照組和實驗組的表格內滴加一滴優碘,用牙籤均勻攪拌後,觀察兩組顏色變化的差異。若在實驗組的表格內加入碘液後沒有變色(呈現褐色),則表示待測物中含有澱粉酶視為陽性反應,如圖八所示。

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圖八:左邊為對照組;右邊為實驗組,呈現褐色表示待測物含有澱粉酶視為陽性反應

二、  蛋白酶(Proteases

1.        分別在對照組和實驗組的表格內滴加一滴2.5%蛋白液。

2.        以刀切、擠壓、撕開或壓汁等方式,使各種天然食物或加工食品成為細碎狀或液狀,在實驗組的表格內加上少許待測物,對照組則不加;然後用牙籤均勻攪拌實驗組的混合液。

3.        等待5分鐘後,在對照組和實驗組的表格中,分別滴加一滴雙縮脲試劑。若原來食物中含有蛋白酶,則在實驗組的顏色依舊是藍色視為陽性反應,如圖九所示。

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圖九:左邊為對照組;右邊為實驗組,依舊呈現藍色表示待測物含有蛋白酶視為陽性反應

三、  脂肪酶(Lipase

1.        在實驗組的表格內,滴加一滴植物油,攪拌均勻。

2.        以壓汁等方式使待測物成液狀,或直接使用液體的待測物,分別在對照組和實驗組表格內滴加一滴待測物。

3.        等待5分鐘,再分別加上一滴酚紅指示劑,若在對照組呈現紅色且在實驗組呈現黃色,則表示待測物含有脂肪酶視為陽性反應,如圖十所示。

4.        此時,若發現對照組和實驗組皆呈現黃色,則表示待測物為酸性。則需要使用0.025 M NaOH,調整待測物成為中性或弱鹼性。調整作法:在對照組上,滴加一滴0.025 M NaOH,用牙籤均勻攪拌,若還是呈黃色,再滴加一滴,直到呈現粉色,記下滴數;然後在實驗組上,滴入相同滴數的0.025 M NaOH,攪拌均勻,觀察兩組顏色的差別。若在實驗組呈現黃色,則表示待測物含有脂肪酶視為陽性反應,如圖十所示。

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圖十:左邊對照組呈現紅色;右邊實驗組呈現黃色表示待測物含有脂肪酶視為陽性反應

四、  過氧化氫分解酶(Catalase

1.        分別在對照組和實驗組表格上各滴加二滴3% H2O2

2.        以刀切、擠壓、撕開或壓汁等方式,使各種天然食物或加工食品成為細碎狀或液體狀,在實驗組上放置待測物。

3.        觀察是否有冒泡的現象。若有冒泡現象,則表示待測物含有過氧化氫分解酶,如圖十一所示。

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圖十一:有冒泡現象表示待測物含有過氧化氫分解酶視為陽性反應

n  結果與討論

本實驗檢驗的酵素待測物(食物名稱)有:綜合酵素(購自藥局)、木瓜、香蕉、蕃茄、蘋果、櫻桃、小黃瓜、普洱茶,檢驗結果如圖十二所示。

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圖十二:待測食物的酵素檢驗結果(上下兩張)

待測物(如澱粉酶)與反應物(如0.5%澱粉)的反應時間需要等待5分鐘,反應完全才可再滴加檢驗試劑(如碘液),否則檢驗容易失敗。檢驗結果:大部分的蔬菜水果類可觀察到有明顯的氣泡,表示含有過氧化氫酶。在脂肪酶的檢驗方面,原本變成黃色後,經過2分鐘後會變回粉色,其原因有待探討。

待測物呈現陽性反應者如表一所示。陽性反應非常明顯者,以「+++」表示;普通明顯者,以「++」表示;稍微明顯者,以「+」表示:陰性反應者,以「」表示。

表一:待測物的酵素檢驗結果

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根據表一的檢驗結果,所有檢驗的待測物中含澱粉酶者有綜合酵素和香蕉;含蛋白酶者有綜合酵、木瓜·、蕃茄及蘋果;含脂肪酶者有綜合酵素、蕃茄、蘋果及櫻桃;所有水果都含有過氧化氫分解酶,非水果類(綜合酵素和普洱茶)則不含過氧化氫分解酶。

n  廢棄物處理和安全注意事項

l  在配製雙縮脲試劑時,必須注意藥品加入順序,先加氫氧化鈉溶液,再慢慢地加氯化銅溶液。若相反程序加入,則無法充分製造鹼性環境,此時氯化銅會與NaOH發生複分解反應,生成藍色的氫氧化銅沉澱,導致觀察現象不清楚。配製此試劑時一定要邊加入邊攪拌,而且必須新鮮配製,長時間放置易生成氫氧化銅沉澱。

l  檢驗完後,可用衛生紙擦拭檢驗的殘留物,丟棄到一般垃圾統。檢驗表的紙張和擦拭乾淨的塑膠資料夾可回收再利用。

l  檢驗酵素需要等待3~5分鐘,等反應完全才加入檢驗試劑,不宜過急加入,否則檢驗容易失敗。

n  教學提示

l  上課時間:教師實驗解說:約15分鐘,學生分組與領取待測物:約510分鐘,學生實驗操作和記錄:約20分鐘。學生資料處理(家庭作業或課堂討論):約15分鐘。若事前規劃好學生分組與待測物分配,可以節省上課時間約5~10分鐘。

l  本實驗可配合新舊課程綱要的相關學習內容實施,並且可規劃為探索方式或探究導向的實驗活動。

l  教師可以在上實驗課前,分配學生組別,並指定需要攜帶待檢驗的食物種類。

n  結語

酵素為人體維持生命不可或缺的生化反應的催化劑,由於其涉及的生物化學原理深奧,對中小學生難以理解,以致在國內課程綱要中在高中階段提到學生的學習內容僅為簡易的知識面介紹,沒有規範學生操作的化學實驗。然而,在網際網路中,可發現豐富的英文資料,詳細地介紹食物和食品的酵素檢驗,不過這些檢驗絕大部分採用大量或少量的藥品,以致產生多量的廢棄物。透過仔細的設計並經過測試和改良,本微量實驗以檢驗表和透明資料夾取代試管和燒杯,不但簡易方便而且不具危險性,降低藥品成本和減少廢棄物,器材可回收再利用,並且減少操作時間,實驗場地不受限制,可以在教室中進行。期望透過此實驗的操作,讓學生認識自己常吃食物的酵素,也體驗化學與生活的密切關係,並享受操作化學實驗的樂趣

n  參考資料

1.      Carbohydrate tests, http://goo.gl/oCiYGO.  

2.     雙縮脲試劑,https://zh.wikipedia.org/wiki/雙縮脲試劑

3.     蛋白酶,https://zh.wikipedia.org/wiki/蛋白酶

4.     脂肪酶https://zh.wikipedia.org/脂酶

5.     Enzyme experiment amylase, starch, iodine, https://goo.gl/xLUZhJ.  

6.     Testing for enzymes, http://goo.gl/J4qAHP.

7.     Enzyme lab – Ex. 4, http://samson.kean.edu/~breid/enzyme/enzyme.html.

8.     Laboratory #5 – Enzymes, http://goo.gl/qUjiRf.  

9.     Digestion and enzymes, http://goo.gl/Zh7O2v.

10.   Digestive enzymes, https://goo.gl/znwoua.  

n  學生實驗手冊

下載本微量實驗的學生實驗手冊常見食物酵素的微量檢驗」。

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