奈米/團簇實驗課程設計與應用

古國隆

國立嘉義大學應用化學系

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相較於其他科技領域，「奈米科技」算是新興的科技領域，世界各國都投注大量的人力及資源，進行與奈米相關的研究，期望能將奈米科技成功地應用在與食、衣、住、行等各方面，開啟另一波的產業革命，最終達到提升國家競爭力的目標。台灣也不例外，政府在民國90年的全國科技會議中即將「奈米科技」列為未來生醫、材料、能源、資訊、微機電等之共同發展基礎¹，科技部、中研院、經濟部、工研院、及教育部等機構也持續推動與奈米科技相關的各種大型計畫，以達到「在學術方面有卓越研究，以支持奈米科技產業化」的目標²。因此台灣在奈米相關學術及產業研究方面已有相當豐碩的成果，奈米材料適用的範圍除了生醫檢測、藥物傳遞外，還擴及太陽能電池、IC電子、顯示器等民生工業。

奈米科技的發展需要人才培育，除了藉由國家主導的大型跨領域奈米科技人才培育計畫，培育專業研發人才外，同時也希望奈米科技教育能向下紮根，提升各級學校學生對奈米科技的認識及興趣。近年來，台灣國小、國中、及高中端的奈米科技教育已有一定的基礎，但科技的進步日新月異，與十年前相比，奈米材的種類更多元、製備更簡單、應用性更廣泛，教材當然也需要被更新。為了更有效地啟發學生對科學的興趣，「動手做」在教材設計開發中是必要的元素，學生從實驗中觀察，過程中的任何的變化，如顏色改變、沉澱析出、氣體產生、發光發熱等都能讓學生留下深刻的印象，這樣的學習模式應比課堂上的解說更能激起學生的熱忱。

奈米材料最著名的例子莫過於金奈米粒子，20 nm大小的金奈米粒子呈現酒紅色，最早是用來彩繪陶瓷或加在玻璃中做成美麗的器皿，因其令人驚艷的顏色、容易製備、易於修飾、及良好的生物相容性等特質，使金奈米成為與奈米相關研究的首選。隨著合成技術的精進，除了金奈米外，有如銀、鈀、鉑、或其他複合奈米材料被合成出，奈米粒子的形狀也不只局限於球狀，有三角平板、六面體、二十面體等許多不同的形態，對於球形的奈米粒子而言，小還要更小，從奈米的尺寸做到團簇等級，當奈米粒子小到團簇等級時，這些奈米材料會發出螢光，展現出特別的光學性質。這樣的實驗聽起來好像很困難，需要先進的儀器設備及昂貴的藥品，但實際上不然，本期專刋所邀請的作者皆為在奈米科技領域鑽研多年，研究經驗豐富的老師，也因此能將前緣尖端科技簡單化，利用高中實驗室方便取得的設備及藥品，甚至是利用在便利商店就能買到的飲料，在合理的時間範圍內就能合成出奈米材料，除了合成外，也進一步鑑定及探討所合成材料之特性，從奈米材料的合成、鑑定、到最終的應用，提供了可供高中生操作的完整實驗，設計實驗時也考量所使用藥品的用量、毒性、及對環境的影響，使實驗能符合「綠色化學」的要求。

第一篇是由國立中正大學周禮君教授所設計的「金奈米粒子合成與感測教學實驗模組」是金奈米粒子經典實驗之匯集，包含了四個具關聯的實驗，先以Turkevitch的方法，以檸檬酸根當成還原劑及保護劑合成金奈米粒子，再將金奈米粒子固定在玻璃上，因奈米粒子易受外在環境的影響而改變光學性質，可以利用紫外/可見光光譜儀來探討折射率對光譜之影響，這樣的模組化實驗可以讓學生循序漸進，對奈米粒子的特性有完整的認識。

第二篇「奈米好好玩–簡易螢光金奈米團簇製備及重金屬汞離子檢測應用」是由國立彰化師範大學化學系林泱蔚教授所設計的實驗，使用雞蛋中的蛋白質做為板模及保護劑，及利用微波爐加熱，在5分鐘內便可成功地合成出會發出粉紅色螢光的金奈米團簇，相較於其他合成團簇的方法，這個方法材料成本低廉、没有毒性且容易取得，合成的團簇還可以用來偵測汞離子。林教授除了在文章中詳細地介紹了實驗的原理及步驟，還提供了教師及學生手冊供参考，方便教師將奈米團簇實驗納入實驗教學中。

第三及第四篇都是利用電化學的方法合成碳奈米點，分別由國立台灣大學化學系張煥宗教授及國立台東大學應用科學系胡焯淳教授提供，張教授更進一步改進了電化學的裝置，讓合成變得更加容易、安全。碳奈米點與金屬團簇相同，具有特殊的螢光性質、較佳的生物相容性，也比較不會造成環境的污染，可以做為一種新的螢光感測器。實驗時所需要的「碳」可以來自非常生活化的材料，如在胡教授所設計的實驗中，使用果汁做為碳的來源，因所用的碳源不同，做成碳奈米點後，會影響奈米點所發出螢光的顏色及強度。碳奈米點如做為螢光偵測器，可以用來偵測金屬離子及酸鹼度。

國立嘉義大學應用化學系黃正良教授在第五篇「從光合成三角形奈米銀到彩色奈米銀製備」中，以銀做例子，非常詳細地介紹了奈米粒子形狀對顏色的影響，及如何以照光的方式合成三角平板，在合成好的三角平板銀奈米中加入KBr後，便開始進行截角反應，隨著奈米粒子形狀改變，銀奈米呈現豐富的顏色變化，與銀塊材閃亮亮的顏色不同，讓學生印象深刻。

第六篇則是由中國醫藥大學藥用化妝品學系莊宗原教授介紹一種陰離子黏土材料「層狀雙氫氧化合物（LDHs）」的合成方法及相關的應用。層狀氫氧化合物含有二價及三價的金屬離子，層間的陰離子具可交換性，可以嵌入不同的分子，增加其應用性。有鑑於高中生對這種奈米材料較為陌生，莊老師拍攝了詳細的合成教學影片，可供有興趣的教師或學生参考。

在108年新課綱即將實施之際，專刋中所討論到與奈米材料相關的實驗剛好能讓對化學有興趣的學生在研究題材上多一些選擇，增加學生對奈料科技的認識。最後要感謝教授們將自己精采的研究成果轉譯為有趣且適合中小學生之實驗教材，也特別要感謝本期擔任執行編輯的國立嘉義大學應用化學系連經憶教授，她熱心的提供意見、邀稿、整合、編輯，才使本專輯有如此的貼近研究前緣的科普實驗。

1.        劉祥麟。台灣奈米科技研究體系之簡介。物理雙月刋，2001，23卷6期，第599頁。

2.        台灣奈米發展，奈米新世界。https://nano.nstm.gov.tw/NanoConcept/NanoDevelopment/NanoInTaiwan.htm

3.        M. Daniel and A. Astruc. Gold Nanoparticles: Assembly,
Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications
toward Biology, Catalysis, and Natotechnology. Chem.
Rev. 2004, 104,
293-346.

奈米/團簇實驗課程設計與應用:

奈米好好玩－簡易螢光金奈米團簇製備及重金屬汞離子檢測應用

謝佶霖、林穎巧、鄭碧雲、林泱蔚^*

國立彰化師範大學化學系

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• 摘要

本實驗主要介紹螢光金奈米團簇的合成與其重金屬檢測的應用。第一部分以家用微波爐進行微波反應，利用雞蛋白做為板模及保護劑，並且以蘇打維持鹼性環境，雞蛋白中胺基酸(色胺酸及酪胺酸)就能將金離子還原成具有螢光性質的金奈米團簇。合成條件以雞蛋白及蘇打做反應試劑，搭配家用微波爐加速反應(反應時間5分鐘)，故符合綠色化學的原則。使用370nm為激發波長，雞蛋白–金奈米團簇會放出紅色螢光(波長為646nm)，並計算雞蛋白–金奈米團簇的量子產率為2.3%。第二部分將雞蛋白–金奈米團簇與不同的重金屬離子混合，可觀察因為Hg²⁺-Au⁺間之金屬親核鍵結的關係，發現只有汞離子能使雞蛋白–金奈米團簇的螢光產生消光反應。利用此機制檢測汞離子，其最低檢測濃度為5.0mM。本篇研究發展出來的螢光金奈米探針具有簡單、快速合成、高選擇性及對環境友善的優點，非常適合發展於高中及大學階段之基礎實驗，使高中生及大學生能瞭解奈米科技在生活上之應用。

一、前言

奈米材料因有別於塊材的物性以及化性，導致其成為學者主要研究對象。近年來，金奈米團簇(gold nanocluster, AuNCs)的合成與應用則被廣泛地關注及討論。金奈米團簇是粒徑小於2 nm的金奈米材料，通常是由數十至數個金原子所組成。和金奈米粒子相比較，金奈米團簇在暗室下受紫外光的照射會顯現出其螢光性質，呈現橘紅色的螢光。其原因為金奈米團簇的量子效應所致，即當物質的大小縮小至奈米尺度範圍時，其物理性質或化學性質會產生重大改變，能階狀態也會從連續態轉為不連續態。因此，金奈米團簇經紫外光激發後，電子會由基態躍遷至較高的能階(激發態)，經過內轉換後，電子會先下降至較低的能階，最後再降至基態並放出能量，放出能量的形式為產生橘紅色的螢光。此具螢光特性之金奈米團簇將可發展成生物探針、細胞標定試劑與重金屬離子感測器。

金奈米團簇的製備方法多樣化，包括(1) 化學還原法：直接加入強還原劑(硼氫化鈉)至金離子溶液中，使正三價金離子還原成正一價金離子與金原子，再組裝成金奈米團簇。然而此方法所需反應間較長，且需加入強還原劑，對環境不友善。(2) 微波輔助法：為縮短反應時間、加熱及粒子大小均勻性，可透過電磁微波方式，使溶液分子極化震盪摩擦，進而使反應溶液加熱。因此，奈米材料之製備會使用微波輻射方式輔助合成。(3) 超聲波合成法：在反應溶液中施加高強度之超聲波，使溶液不斷產生氣泡生成及崩解現象，進而在溶液環境中產生如剪切力及衝擊波等物理作用力，幫助化學反應進行。其優勢為反應速率快與粒子粒徑均勻，然而受限於反應過程中所造成的噪音污染及易生成副產物。(4) 光化學還原法：利用高能量紫外光照射反應溶液，產生高還原能力之自由基，進而產生還原反應。此方式具備合成簡單、成本低及低毒性之優勢。但是，粒子粒徑均勻度不佳。(5)核心侵蝕：在金奈米粒子溶液中，加入硫醇分子等氧化劑，使其形成可溶性之金–硫小分子達到縮小原本尺寸的效果。此方式缺點為氧化侵蝕反應往往耗費時間，且粒徑大小不均勻。(6)模板輔助法：利用蛋白質及胺基酸等生物分子作為金奈米團簇生長的模板，提供良好的生成骨架，使金原子能穩定組裝成長。此合成方式簡單，常使用一鍋反應合成法進行製備。由於金原子穩定成長及鑲嵌在生物分子中，故無需再添加保護劑。

二十世紀中葉，汞金屬對於環境污染開始廣泛被世人所重視，起因於日本熊縣水俁市所發生的集體汞中毒事件，造成重大的人員傷亡、後遺症及環境汙染，成為日本四大公害病之一，後人稱「水俁病」。無機汞會經由環境中的微生物作用轉變成毒性較高有機汞，藉由食物鏈累積於較大型的動物體內，進而被人類攝取，影響中樞神經或其他器官的運作，如肝臟、腎消化系統，對人體造成不可逆損害。美國國家環境保護局規範，飲用水中的汞含量不可以超過2 ppb (10 nM)，於工業用水中則不能超過 50 ppb (250nM)；歐盟規範飲用水中的汞含量不可以超過1 ppb (5 nM )；美國食品與藥物管理局則規定海鮮中的汞濃度最大上限為1 ppm (5 mM)。現今在檢驗上，使用高效液相層析質譜儀、感應耦合電漿/質譜儀與原子吸收光譜儀等分析儀器來檢測汞金屬，但上述的測量方法受限於設備昂貴、樣品前處理複雜、檢測時間較長，無法即時地檢測，所以開發簡單且能快速偵測汞金屬離子之感測器是必需。

近年來，有關金奈米團簇的研究議題吸引了許多學者的關注並致力於相關的發展。因為金奈米團簇擁有螢光特性、製備簡單、與水溶液有較好的相容性與毒性較低等優點。但綜觀不同單位的研究，大多都有添加對環境較不友善的強還原劑，或者使用經純化的蛋白質作為合成板模，如牛血清蛋白、溶菌酶或人血清白蛋白等，使得金奈米團簇的製備成本提高且較不符合綠色化學的原則，所以本文希望能使用雞蛋白取代經純化後的蛋白質來降低金奈米團簇的合成成本，並結合家用微波爐輔助進行加熱，加快反應速率及縮短合成時間，取代昂貴的微波輔助反應器，來降低整體材料的製備成本，開發具選擇性、綠色、低毒性的螢光感測器。另外，我們以金奈米團簇當做螢光探針來檢測重金屬汞離子。由於Hg²⁺與Au⁺在電子殼層間的d¹⁰軌域中會形成作用力強的金屬親核鍵，此鍵結會影響受紫外光激發的電子躍遷情形產生消光現象，達到定性定量之效果。因此，本文重點將包含：(1)學習以雞蛋白、碳酸鈉、四氯金酸與微波爐進行綠色化學合成法，合成螢光金奈米團簇。(2) 比較不同重金屬離子對螢光金奈米團簇之影響，並探討其選擇性及靈敏度。希望本文能提供高中及大學階段之基礎實驗，使高中生及大學生能以動手做實驗方式，瞭解奈米科技在生活上之應用。

二、實驗方法

1.        藥品

所有藥品皆為分析等級未經任何純化處理。四氯金酸、碳酸鈉、氯化汞、硝酸鉛、硝酸鎘、硝酸鎳、氯化鋇、氯化鈣、氯化鈉、硝酸鍶、硝酸鎂、氯化鐵、氯化亞鐵、硝酸銅及碳酸鈉皆購買於Sigma Aldrich。三羥甲基胺基甲烷、鹽酸及核黃素-5’磷酸鹽分別購買於JT-Baker及Acros。新鮮雞蛋購買於當地商店。所有水溶液皆以去離子水當做溶劑進行調配至所需要濃度。 

2.        器材

取一顆新鮮的雞蛋，首先分離雞蛋白及蛋黃。再將雞蛋白置於大樣品瓶中，在樣品瓶中放入磁石並置於磁石攪拌器上，以650 rpm攪拌20分鐘，便完成雞蛋白的前處理。取經前處理的雞蛋白500 mL、去離子水1500 mL與0.6 M碳酸鈉100 mL搖晃均勻後，再加入10 mM四氯金酸500 mL，封上保鮮膜，戳一小洞放置於燒杯中，再封上保鮮膜，以低火（功率為120 W）微波兩分半鐘、間斷兩分鐘，再微波兩分半鐘，便完成金奈米團簇的合成。再以17000 rpm 離心30分鐘去除溶液的雜質，以利後續實驗。藉由攜帶式紫外光的照射，清楚看見金奈米團簇溶液呈現淡粉紅色的螢光。利用螢光光譜儀 (激發波長：370 nm) 可測得550－800nm有螢光放光波段。

雞蛋白–金奈米團簇的量子產率計算方式是利用核黃素-5′-磷酸鹽做為比較標準品，其量子產率為26％。實驗方法為分別測量五種不同濃度的雞蛋白–金奈米團簇與核黃素-5′磷酸鹽的螢光光譜 (激發波長：370 nm，放光波長：470－780 nm) 及吸光強度(400 nm)。為避免自吸收，維持吸光強度 (400 nm) 的數值小於0.1。以波長為400 nm的光強度與螢光光譜放光波長470－780 nm的積分面積作圖，計算出線性關係，將兩者的斜率做比較，便可求得雞蛋白–金奈米團簇的量子產率。

4.        雞蛋白–金奈米團簇在重金屬離子檢測應用

配製10 mM不同金屬鹽類的金屬離子溶液，分別為：鈉離子、鎂離子、鐵離子、亞鐵離子、鈣離子、銅離子、鎳離子、鉛離子、鎘離子、鋇離子、鍶離子及汞離子。依序取0.1 mL不同金屬離子溶液加入由0.1 mL的100 mM Tris-HCl (pH9.0)的緩衝溶液與雞蛋白–金奈米團簇(0.7 mL)所組成的混合溶液，充分搖晃反應5分鐘，使溶液均勻混合後再利用螢光光譜儀測量螢光強度。

配製0.1 M的Hg²⁺溶液並用超純水稀釋成濃度10－1000 μM。依序取0.1 mL不同濃度的Hg²⁺離子加入由0.1 mL的100 mM Tris-HCl (pH 9.0)的緩衝溶液與雞蛋白–金奈米團簇(0.8 mL)所組成的混合溶液，充分搖晃反應5分鐘，使溶液均勻混合後再利用螢光光譜儀測量螢光強度。

三、結果與討論

在四氯金酸的還原反應中主要會形成粒子與團簇兩大類。以金奈米粒子為例，主要是利用檸檬酸鈉還原四氯金酸的金離子形成金奈米粒子，可藉由不同反應條件製備出不同尺寸的金奈米粒子，如13nm及32nm 金奈米粒子。金奈米粒子廣泛應用於生物醫學或分析檢測。團簇是介於分子、原子與物質間的過度狀態，性質不同於原子分子，也不同於物質，是以穩定且獨特的狀態存在，且會因尺度大小的不同而改變，本文即是以金奈米團簇為主要探討對象。

在本實驗中，金奈米團簇是於鹼性的條件下藉由微波爐輔助的方式製備合成。利用四氯金酸與雞蛋白並加入碳酸鈉維持弱鹼的環境，再配合家用微波爐的使用，製備出金奈米團簇。雞蛋白在反應中作為模板及保護劑，其所含的色胺酸與酪胺酸在鹼性條件下可將四氯金酸所提供的Au³⁺還原成Au⁰及少部分的Au⁺，雞蛋白的黏稠性能將金原子(Au⁰)聚集成小單元，並於單元外附著少量Au⁺，其雞蛋白的立體障礙又能防止過多的金原子(Au⁰)聚集，控制金奈米團簇為適當的大小，同時雞蛋白所含的蛋白質能藉由凡得瓦力穩定吸附在金奈米粒子表面上作為保護劑維持金奈米團簇的穩定性。

在圖一吸收光譜圖及螢光光譜圖中，可以觀察出雞蛋白–金奈米團簇於可見光波帶並無明顯的吸收峰，且溶液（圖一附圖）呈現深黃色。相較於金奈米粒子因為表面電漿共振的原因，於～520nm的波段有明顯的吸收特徵峰，溶液顏色成紅紫色。於螢光光譜中，可以發現雞蛋白–金奈米團簇是具有螢光特性的物質，其激發波長為370nm，最大放光波長為646nm，為淡粉紅色的螢光（圖一附圖）。雞蛋白–金奈米團簇的螢光特性來自於本身極小的尺寸，以致產生像分子般的HOMO－LUMO電子能階，使得電子能在能階躍遷，進而放出螢光。另外，螢光性質與雞蛋白–金奈米團簇表面附著的配位基團與穩定分子也有強烈的關係，電子可能會從富含硫原子的配位基團傳遞至雞蛋白–金奈米團簇的金核中；或者多電子的配位基直接將電子捐獻給雞蛋白–金奈米團簇的金核中，使得電子能夠在能階當中躍遷，產生螢光的特性。

利用量子產率為26%的核黃素-5′-磷酸鹽作為標準品，來量測雞蛋白–金奈米團簇的量子產率。分別測量五種不同濃度的雞蛋白–金奈米團簇與核黃素-5′磷酸鹽的螢光光譜（激發波長：370 nm，放光波長：470－780 nm）及吸光強度（OD：400 nm）。以波長為400 nm的光吸收強度與螢光光譜放光波長470－780 nm的積分面積作圖，計算出線性關係，將兩者的斜率做比較，可求得雞蛋白–金奈米團簇的量子產率約為2.3%。

圖一、雞蛋白–金奈米團簇之吸收光譜及螢光光譜，且最大螢光放光波長為646 nm；左上角的附圖為照射手提式紫外光前後的照片(激發波長為370 nm)。

進一步，我們藉以螢光的特性來檢測重無機汞離子，由於Hg²⁺與Au⁺在電子殼層間的d¹⁰軌域中會形成作用力強的金屬親核鍵，此鍵結會影響受紫外光激發的電子躍遷情形，阻礙激發態的產生，而產生消光現象。欲了解雞蛋白–金奈米團簇對汞離子的偵測專一性，在雞蛋白–金奈米團簇溶液中，分別加入鈉離子、鎂離子、鐵離子、亞鐵離子、鈣離子、銅離子、鎳離子、鉛離子、鎘離子、鋇離子、鍶離子及汞離子，且加入Tris－HCl緩衝溶液(pH
9.0)做為檢測條件。在圖二的附圖中可以發現，只有汞離子能使雞蛋白–金奈米團簇產生明顯的消光反應，其溶液顏色在手提式紫外光的照射下呈紫紅色。

圖二、雞蛋白–金奈米團簇加入不同金屬離子的照片。汞離子濃度為1.0 mM；其金屬離子濃度則為10.0 mM (激發波長為370 nm)。

最後，針對雞蛋白–金奈米團簇對汞離子的偵測靈敏度做探討，在雞蛋白–金奈米團簇溶液中加入不同濃度的汞離子溶液，由圖三可以觀察到隨著添加的汞離子溶液濃度越大，其雞蛋白–金奈米團簇溶液的螢光強度削弱程度也隨之增大，可由此計算出雞蛋白–金奈米團簇偵測汞離子的最低偵測極限為5.0 mM。

圖三、不同濃度的汞離子溶液對於雞蛋白–金奈米團簇所造成的螢光消光圖。附圖為雞蛋白–金奈米團簇加入不同濃度汞離子溶液（5.0－100 mM）的照片。

四、結論

本文成功利用成本低廉且來源容易取得的雞蛋白取代經純化的蛋白質，並結合家用微波爐提供均勻的加熱五分鐘，便能合成出雞蛋白–金奈米團簇。此雞蛋白–金奈米團簇可以作為汞離子偵測探針，最低可以偵測到濃度為5.0 mM。本合成方法的優勢包括：(1)低成本：合成過程無須利用昂貴的微波合成儀器，且合成材料也無需使用較昂貴的蛋白質來源。僅使用雞蛋白、蘇打及家用微爐，即可合成出具有螢光特性的雞蛋白–金奈米團簇。(2)節省時間：本實驗合成的反應時間因配合家用微波爐的使用只需五分鐘，另外偵測重金屬離子所需的反應時間也只要五分鐘，所以具有合成與偵測快速的優點。(3)綠色合成方法：本實驗使用家用微波爐微波輔助的合成方式來增加反應率，對環境汙染較低的雞蛋白作為還原劑與保護劑，及使用蘇打取代強鹼氫氧化鈉調控合成環境，符合綠色合成方法準則。(4)即時性偵測：可以透過肉眼就可以辨別螢光的顏色，可以作為初步判別汞離子於水樣中的濃度，可即時應用於採集水樣的現場。故本教材非常適合用來對於高中生及大學生進行奈米科技的動手做教學(附錄為本文之教師及學生手冊)。未來希望對此雞蛋白–金奈米團簇進行更進一步研究，提高對汞離子的偵測靈敏度，且將其延伸應用於生物成像、藥物載體以及抗菌實驗等面向，利用其優勢發展更全面性。

補充資料：

微波輔助綠色合成法製備螢光金奈米團簇與其重金屬汞離子檢測應用之教師手冊（附件一）及學生手冊（附件二）。

致謝：

本研究經費補助來自於臺灣科技部合約編號(MOST 107-2515-S-018-002)及(MOST 107-2514-S-018 -005)。

五、參考文獻

1. Xie, J., Y. Zheng, and J.Y. Ying, Protein-directed synthesis of highly fluorescent gold nanoclusters. Journal of the American Chemical Society, 2009. 131(3): p.888.

2. Yan, L., et al., Microwave-assisted synthesis of BSA-stabilized and HSA-protected gold nanoclusters with red emission. Journal of Materials Chemistry, 2012. 22(3): p. 1000.

3. Shang, L., et al., Microwave-assisted rapid synthesis of luminescent gold nanoclusters for sensing Hg²⁺ in living cells using fluorescence imaging. Nanoscale, 2012. 4(14): p. 4155.

4. Hu, D., et al., Highly selective fluorescent sensors for Hg(II) based on bovine serum albumin-capped gold nanoclusters. Analyst, 2010. 135(6): p.1411.

5. Chen, P.-C., C.-K. Chiang, and H.-T. Chang, Synthesis of fluorescent BSA–Au NCs for the detection of Hg²⁺ ions. Journal of Nanoparticle Research, 2012. 15(1): p.1.

6. Xie, J., Y. Zheng, and J.Y. Ying, Highly selective and ultrasensitive detection of Hg²⁺based on fluorescence quenching of Au nanoclusters by Hg²⁺-Au⁺interactions. Chemical Communications,
2010. 46(6): p. 961.

• 教師手冊（附件一）
• 學生手冊（附件二）

奈米/團簇實驗課程設計與應用:以電化學法合成用於銅離子檢測之碳點

林于鈊、林雅玲、林裕軒、張煥宗*

國立臺灣大學化學系

*[email protected]

前言

碳點（carbon dot; Cdots）一般是指尺寸小於10奈米，形狀近似球型且能穩定發光的一種碳材，已成為一種新型的螢光材料。其具備寬且連續的激發光譜、穩定的螢光性能、良好的生物相容性及低毒性，並可透過化學修飾碳奈米點表面官能基團使其進一步功能化，在傳感器、生物成像、標記和檢測等領域有著良好的應用前景。

除具有類似半導體量子點光致發光特性外，碳點還會有激發放光波長相依放光特性（excitation-wavelength-dependence emission），即碳點在不同波長的激發光照射下，可放出不同波長的螢光^[1]。雖至今還沒有完整的科學證據及理論可解釋此獨特放光性質，但一般相信它的放光性質和其表面及核的組成有關；即它的發光和電子電洞對、量子侷限效應與邊緣效應（edge effect）有關。因此，碳點的吸收和放光性質與碳點的表面缺陷、電荷分布與大小有關。與大部分發光奈米粒子(如金屬團簇和半導體量子點)相較，碳點具有相當高的光和化學穩定度。在紫外光連續照射六小時下，其螢光強度變化小於10%。另外，在pH值4.0-10.0間或者在500 mM NaCl水溶液中，其中分散度和螢光強度的變化幾乎可忽略。

常見碳點合成方法為水熱法，但需使用較昂貴的熱或微波反應爐、耗能且反應時間長，不利於課堂演示或學生操作。本研究團隊開發了低耗能、低成本及快速的電化學合成法，使起始物碳源經過氧化(oxidation)、聚合(polymerization)、碳化(carbonization)與鈍化(passivation)的過程形成碳點^[2]。此反應可利用一個簡易的電化學反應裝置和少量的起始物碳源，進行快速且安全反應，因此方便於教學實驗室教學、課堂上演示、或學生課後自行操作。

透過起始物碳源的選擇，可產生具有光學性質、表面官能基團和水中分散度不同的碳點，有利於針對分析物性質開發靈敏度高且具選擇性的螢光奈米感測器。本文利用組胺酸(histidine)前驅物，與碘化鈉(sodium iodide)、氫氧化鈉配製成水溶液，在室溫、鹼性(約pH
9.0)及10伏特的恆定電壓下，製備碳點水溶液。藉由碳點和銅離子作用會形成Cu^2＋-histidine錯合物及引發電荷轉移，進而使碳點的螢光淬滅的現象，檢測水樣品中的銅離子。

器材與藥品

1.  電化學反應設備，含電化學反應器、反應槽(含2mm碳電極2支)和420-nm LED光源1支，皆購自http://kaishinedu.com。

2.  10和25mL量瓶各一個(若無或僅半定量實驗，可用量筒取代)、10與1mL針筒、0.22小飛碟濾膜各1個，20mL 玻璃樣品瓶8個。

3.  組胺酸反應試劑：秤取組胺酸鹽酸鹽1.34克與碘化鈉1.5克，溶於7 mL的純水中。完全溶解後，再加入0.4克氫氧化鈉，待完全溶解後，再加水至10mL。

4.  磷酸緩衝液(200 mM, pH 3.0)：將0.3mL磷酸與0.075g二水合磷酸二氫鈉依序緩慢加至20mL純水中，完全溶解後，再加水至25mL。

5.  金屬離子溶液：分別準備10 mM 氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、氯化鐵、氯化銅、氯化鋅水溶液(含10 mM 鹽酸)，各10 mL。

合成碳點

1.  取7mL組胺酸反應試劑，倒入反應槽中，蓋上反應槽蓋子，接上反應座的連接線與電源線，如圖1。

圖1:電化學反應器

2.  開啟電源進行反應，觀察反應槽內的變化，可發現溶液由無色透明慢慢變成黃色，再漸漸變成深棕色，如圖2所示。20分鐘後關閉電源。(注意：反應過程中會產生少量氣體與高熱，請在通風良好處進行實驗，且小心燙傷)

圖2：反應過程中，溶液顏色變化情形。

3.  靜置10分鐘，待反應槽降溫後，以10mL針筒取碳點溶液，並以小飛碟濾膜過濾溶液，放入乾淨樣品瓶中備用。

4.  取0.1mL 碳點溶液，加入9.9mL 純水，配製成稀釋100倍的碳點稀釋液。

5.  取1個乾淨樣品瓶，瓶外標示control(控制組)，加入4 mL純水後，分別加入0.5mL 磷酸緩衝液與0.5mL碳點稀釋液，搖晃混合均勻後，再以420-nm LED燈照射，可看到溶液發出青綠色的光。

以碳點檢驗水溶液中銅離子

1.  取6個乾淨樣品瓶，分別標示鉀、鎂、鈣、鐵、銅與鋅，每個樣品瓶都加入3.9mL純水、0.5mL 磷酸緩衝液與0.5mL碳點稀釋液，搖晃混合均勻。

2.  取0.1mL氯化鉀水溶液，加入標示「鉀」的樣品瓶；取0.1mL氯化鎂水溶液，加入標示「鎂」的樣品瓶，依此方式，將各種金屬離子溶液，分別加到標示對應金屬的樣品瓶中，搖晃混合均勻，觀察到各溶液顏色相近，如圖3(a)所示。

3.  靜置10分鐘後，再個別使用420-nm LED燈照射，觀察每一瓶溶液（包含control）發出的螢光，觀察到加了銅離子的溶液沒有螢光，其餘金屬離子的溶液與控制組發出顏色相同及強度相近的螢光，如圖3(b)所示。

(a)(b)

圖3：(a)未照光，(b)在420-nmLED燈激發下，溶液放光情形。

4.  若實驗室有螢光儀，我們可以對控制組與含銅離子溶液進行定量檢測，發現以波長420nm 光源激發，最大放光波長為505nm，加入銅離子的溶液，在波長505nm的螢光強度比控制組減少了約80%(圖4)。若對碳點溶液進行透析純化(將5 mL碳點溶液置於RC膜透析袋(MWCO=100-500D)，於水中進行24小時的透析)，更可對不同濃度(0-20mM)銅離子溶液進行定量，其相對螢光強度對於銅離子濃度0.3-3.0μM呈線性關係(R² = 0.99)(圖5)，且此方法之偵測極限為0.1μM。

圖4：控制組與含銅離子溶液之螢光光譜圖，激發波長：420nm。

圖5：相對螢光強度對不同銅離子濃度(0.3-3.0μM)的關係圖。

檢測溶液含有透析純化後的點溶液(稀釋1000倍)，與20mM pH 3.0磷酸緩衝液。及分別為銅離子加入前後，碳點在波長420nm的光激發下，放光波長在505nm之螢光強度。

安全注意與廢棄物處理

1.  產生碳點的過程中會產生熱，故反應完畢後先靜置10分鐘，使反應槽降溫後再拿，也可以使用水浴降溫或戴棉織手套拿反應槽。

2.  含鐵、銅、鋅溶液請回收後交由專業廢棄物清理廠商處理，其餘可直接倒入水槽排放。

3.     實驗完畢後，陽極碳棒會沈積膠狀物質，可以純水清洗與衛生紙擦拭後去除。碳棒可重複使用。 

結論

本實驗利用了簡易的電化學方法合成碳點，藉由溶液顏色和螢光來了解碳點的基本光學特性，最後藉由螢光淬滅來檢測水中的銅離子。實驗過程中不使用任何有毒與有機溶液、所需時間短，實驗結果易觀察、產生的廢液量少等優點，提供各位教師一個奈米課程教學的示範實驗。 

參考文獻

1.     Hsu, P.-C.; Shih, Z.-Y.; Lee, C.-H.; Chang, H.-T.* Green Chem. 2012, 14, 917-920.

2.     Wang, C.-I.; Wu, W.-C.; Periasamy, A. P.; Chang, H.-T.* Green Chem. 2014, 16, 2509-2514.

奈米/團簇實驗課程設計與應用:以電化學法利用市售果汁合成螢光碳奈米物質

鄭至崴、何秀倩、邱泰嘉、胡焯淳*

國立台東大學應用科學系

*[email protected].tw

一.簡介

   奈米材料，奈米材料的尺寸介於原子與塊材之間因此奈米材料表現的性質較為特別，目前有以下幾種，常見如金屬奈米粒子、金屬奈米團簇、碳奈米點和奈米級的複合材料等。

  金屬奈米粒子的合成簡便且快速，是種相當容易取得的奈米材料。由於粒子的大小為奈米等級，所以在外觀和許多表徵與塊材有相當大的差異。目前金屬奈米粒子的應用非常廣泛包含殺菌，檢測探針，催化反應，藥物傳輸等。金屬團簇有別於奈米粒子，一般具有特殊的螢光性質，因此此類材料也引起了高度關注。其中以貴金屬銅(Bhamore, Jha et al. 2016)、銀(Tang, Feng et al. 2017)、金(Yang, Zhu et al. 2014)的討論度最高 。但不論金屬奈米粒子或金屬團簇均使用到金屬離子，較易造成環境的汙染與生物相容性之問題。最近新興之碳奈米材料使用最常見的元素碳為主體，可有效避免上述之問題。

碳奈米材料由早期之碳六十，碳奈米管至最近發展的碳奈米點(carbon dots, CDs)。科學家們發現碳奈米點是一種具有螢光特性的奈米材料，原料來源相當多元，例如咖啡渣(Hsu, Shih et al. 2012)、廢棄樹葉(徐晨皓,袁子鈞  et al. 2014)、羊肉(Wang, Xie et al. 2017)等甚或在常見之食物中如市售及溶咖啡(Jiang, Wu et al. 2014)等。分離純化來自食物中的碳奈米物質，更能顯現出碳奈米物質對生物體影響是較低的。碳奈米物質具有可調控性和強大的螢光，使其能在生醫和檢測(Niu, Ying et al. 2018)上有不錯的表現。由於合成方式簡單、價格低廉、低毒性等優勢，碳奈米物質近年來也成為了相當熱門的材料。

    碳奈米物質的合成方式相當多元，例如：水熱法(Liu, Duan et al. 2017)、微波輔助法(Zhai, Zhang et al. 2012) 、超音波合成(Dang, Huang et al. 2016)和本篇之電化學法。相較於上述所提及的其他合成碳奈米物質方法，電化學的優勢在於儀器較為容易取得和花費時間要來的低。之前文獻所提及利用市售筆芯作為電極(黃智盈, 趙仁志  et al. 2018)合成碳奈米物質，我們將稍微修改前篇文獻的合成方法作為本篇合成碳奈米物質的步驟。

          本篇使用的主要材料為市售水果汁。為了提高螢光強度，有許多文獻提出摻雜氮(Atchudan, Edison et al. 2018)元素能提高螢光強度。因此在實驗中也設計了將乙二胺或尿素加入了合成中來提高水果汁碳奈米物質的螢光強度。因此，我們利用了市售水果汁和含氮化合物以電化學合成碳奈米物質。其中探討了三種不同果汁，其結果顯示以檸檬汁作為原料的碳奈米物質螢光較強。此碳奈米物質在 360 nm的激發光下，會有 470 nm的藍色放光。由於此合成之碳奈米物質對 pH值敏感，我們也嘗試了將碳奈米物質製作成 pH值試紙和碳奈米物質凝膠。由結果顯示所合成的碳奈米物質具有酸鹼度開關應用之潛力。

二.實驗步驟

1.器材與藥品

電源供應器(10V)，碳棒(37.5mm× 2)，鱷魚夾 ×2，檸檬汁，水蜜桃汁，柳橙汁，乙二胺(Ethylenediamine ,C₂H₈N₂)，硫酸鈉(Sodium sulfate , Na₂SO₄)，尿素(urea , CH₄N₂O)。20mL針筒，0.45μm注射器過濾膜，加熱攪拌器，燒杯，磁攪拌子。

2.碳奈米物質製備

圖一、 實驗流程圖

(1)將水果原汁稀釋10倍，體積為50mL。

(2)加入乙二胺或尿素，並攪拌 30秒。

(3)加入 0.071g的硫酸鈉，增加導電度。

(4)將碳棒沒入上述所配溶液 2cm，並將攪拌器開啟至 60rpm，開啟電源供應器並將電流設定為 10

伏特，通電 2小時。

(5)將通電兩小時後的溶液用 0.45 μm過濾膜過濾並保存於 4℃冰箱中。

以上之實驗流程如圖一所示。

3.螢光碳奈米物質的性質探討

(1).耐鹽性

   取 200 μL的碳奈米物質於離心管中，加入 1800 μL不同濃度的 NaCl溶液，使最終濃度分別為0.1、0.25、0.5、0.75、1M，震盪反應完成後使用螢光儀偵測。

(2)螢光碳奈米物質的pH值測試

  先在離心管中加入 1600 μL的超純水，再加入 200 μL不同 pH值的磷酸鹽緩衝溶液，最後加入 200 μL的碳奈米物質溶液。震盪混合均勻，反應一小時後使用螢光儀測其螢光變化。

(3).螢光碳奈米物質的金屬離子選擇

  在離心管中加入 1400 μL的超純水，之後加入 200 μL
磷酸鹽緩衝溶液 (pH =4) ，再加入 200 μL各種不同的金屬離子(濃度為 10^-3 M)，最後加入 200 μL
的碳奈米物質溶液。將所配置好之溶液震盪混合均勻，反應一小時後使用螢光儀測其螢光變化。

(4).螢光碳奈米物質的耐光性測試

     將稀釋十倍之碳奈米物質放於石英燒杯中，並放於暗室中。後開啟波長 365 nm的紫外光燈，由上而下照射，每十分鐘取 2mL上螢光儀偵測，共 60分鐘。

4.碳奈米物質之應用

(1)pH 試紙的製備

    將濾紙裁切至 2 cm ×2 cm的大小並放入塑膠培養皿中，以 3 mL的碳奈米物質均勻地滴在濾紙上。待濾紙充分地吸收碳奈米物質後，將塑膠培養皿放入烘箱中。烘箱溫度控制在 40℃，5 ~ 10分鐘後待水分蒸乾後就可得到碳奈米物質試紙。

(2)碳奈米物質凝膠的製備

    先準備一個水浴盆，將 50 mL的碳奈米物質與 250 mL的蒸餾水混合進水浴盆中，之後再加入 6 g的吉利丁片。 將溫度控制在 70℃，加熱攪拌至吉利丁片完全融化。放置室溫 5 ~ 10分鐘，之後放入 4 ℃冰箱中。等完全凝固後就可得到碳奈米物質凝膠。

三.實驗結果與討論

1.     不同種市售果汁的比較

將檸檬汁，水蜜桃汁或柳橙汁稀釋十倍讓體積達 50毫升，之後加入 0.071公克的硫酸鈉增加導電度，最後加入 334微升的乙二胺。

經過兩小時的電化學反應後，電解液的螢光圖譜和照片如圖二、圖三所表示，三種不同果汁的螢光放射都介於 410– 450 nm 之間。從圖可觀察到以檸檬汁作為原料的碳奈米物質的螢光最強，因此後續實驗都以檸檬汁碳奈米物質作為探討。

圖二、不同種市售果汁合成的碳奈米物質在可見光(上)，紫外光(中)與紅光雷射(下)之照片

               圖三、不同種果汁碳奈米物質螢光光譜圖

2.     不同種氮源合成

    在合成的過程中，我們也嘗試了另一種氮來做摻雜。我們以尿素來代替乙二胺作為氮的來源，由圖四可看出，將乙二胺改為尿素後，依然能形成螢光碳奈米物質，但螢光強度不及以乙二胺合成的碳奈米物質來的強。因此之後之實驗以由檸檬汁與乙二胺所合成的碳點為主要之研究標的。

圖四、尿素合成之碳奈米物質

3.     碳奈米物質的耐光性測試

       為了測試碳奈米物質是否能在強烈的紫外光照射下保有穩定的螢光，以手提式紫外光燈做為光源(波長為 365nm)連續照射 60分鐘，實驗結果如圖五。由圖中結果顯示，在照射 10分鐘後，碳奈米物質的螢光有些微下降，在照射 60分鐘後，螢光僅降至原本的80%，顯示此碳奈米物質耐光性良好。螢光下降的原推測為部份碳奈米物質的結構較為不穩固所造成。

圖五、碳奈米物質的耐光性測試

4.     碳奈米物質之耐鹽性測試

          在高離子強度下，容易對碳奈米物質的螢光造成影響。我們以氯化鈉作為離子來源，來探討本篇的碳奈米物質是否能在高離子強度下保有強烈的螢光。實驗結果如圖六所示，在氯化鈉濃度達到 1M時，螢光強度與空白試樣的強度相差不多。由此能表明，碳奈米物質的耐鹽性相當良好。

圖六、碳奈米物質的耐鹽性測試

5.     碳奈米 pH值測試

    將碳奈米物質與不同 pH值的磷酸緩衝溶液混合，觀測在不同 pH 值下碳奈米物質的表現為何。從圖七中看出，碳奈米物質在低 pH值下螢光強度較高，而在高 pH值下螢光強度卻下降，推測原因為碳奈米物質表官能基的質子化/去質子化所造成的螢光變化。

圖七、不同pH值測試之長條圖

6.     金屬離子測試

     此外，我們也測試了金屬離子對碳奈米物質的影響。我們檢測了幾種常見的 18種陽離子(鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、鋇、鋁、鉛、錳、鐵Ⅲ、鐵Ⅱ、鈷、鎳、銅、鋅、汞、銀、金)，結果由圖八所表示，在加入鋅離子後能看出碳奈米物質的螢光強度有明顯的上升。推測有可能原因為加入鋅離子後，碳奈米的結構變得更為穩固，使得螢光強度增強。

圖八、金屬離子測試

7.     碳奈米物質之應用

我們也嘗試將碳奈米物質以試紙的形式來做檢測。由於本篇碳奈米物質對 pH值敏感，所以我們將嘗試製作以螢光方式來做檢測的 pH試紙。先將濾紙浸泡於碳奈米物質溶液中，浸泡五分鐘後將濾紙取出並放置 40℃烘箱中。大約5 – 10分鐘後將試紙取出。將 pH 值 2和 12的磷酸緩衝溶液分別滴上製作完成的試紙上並放在紫外光燈下。由圖八能明顯看出在 pH 值為 2時螢光明顯較亮，而在 pH 值為 12時卻較為黯淡。由上述結果看來，此碳奈米物質有成為 pH試紙的潛力。

圖九、pH值試紙應用溶液態(上)，試紙(下)

      本篇也嘗試了將碳奈米物質製作成凝膠。在電解時，由於凝膠中的水被電解，負極會產生氫離子( 2H₂Oà O₂+4e^– +4H⁺)，而正極的氫氧根離子濃度就會升高( 4H₂O+4e^–à 2H₂+4OH^–)，藉此來達到膠體中的 pH值的變化。由於本篇碳奈米物質對 pH值敏感，所以在 pH 值不同的環境下能有明顯的螢光差異。結果由圖十所表示，可看得出在氫離子濃度較高的負極螢光明顯比其他部位來的強，而氫氧根離子較多的其他部位螢光較弱。

圖九、碳奈米物質凝膠應用

四.結論

    本研究成功利用水果汁和胺類使用電化學法合成螢光碳奈米物質。本篇探討了不同種水果汁和氮元素來源，最後選擇以檸檬汁和乙二胺的組合來做後續研究。由於所合成的碳奈米物質對 pH值敏感，因此可成功將其作為試紙，應用於 pH 值檢測。電解含有碳奈米物質之凝膠時，負極會產生氫離子，由結果所示，在含有較高氫離子濃度的負極，螢光明顯比周圍來的明亮。可見本材料有潛力可應用於酸鹼度之光開關上，未來我們將近一步嘗試將本篇碳奈米材料應用於在環境檢測和細胞成像上。

參考文獻

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